Experimentelle Methode

Ebenso wie die Formel zur Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisses einen dramatischen Einfluss auf die Die scheinbare Empfindlichkeit eines bestimmten Spektraldatensatzes, die Hardwarekonfiguration des Instruments und die experimentellen Parameter der Datenerfassung wirken sich ebenfalls dramatisch auf die Qualität des erfassten Spektrums aus.

Es gibt viele Hardwareparameter. Einstellungen und Optionen, die sich alle auf die gemessene Empfindlichkeit eines Spektrofluorometers auswirken. Dies kann es äußerst schwierig machen, die relative Empfindlichkeit zweier verschiedener Instrumente absolut zu vergleichen, wenn sie nicht auf praktisch identische Weise verwendet werden. Im Folgenden werden die einzelnen Faktoren und ihre Auswirkungen auf die resultierenden Daten erläutert.

Anwendbar auf alle Abtastfluorometer

Anregungswellenlänge: Die Anregungswellenlänge sollte für alle verglichenen Systeme identisch sein. Die HORIBA-Methode verwendet wie die meisten anderen Hersteller eine 350-nm-Anregung für das Raman-Wasserband. Bei Anregung bei 350 nm weist das Raman-Emissionsband für Wasser einen Peak bei 397 nm auf.

Glücklicherweise haben die meisten Hersteller diese Anregungswellenlänge standardisiert, da dies einen besseren Vergleich ermöglicht. Es ist jedoch durchaus gültig, die Anregungswellenlänge auf einen anderen Wert zu verschieben, um die Empfindlichkeit in einem anderen Wellenlängenbereich (z. B. dem NIR) zu testen.

Emissionsabtastbereich: Die HORIBA-Methode scannt den Emissionsmonochromator von 365 bis 450 nm mit Schritten von 0,5 nm, um den gesamten Raman-Peak bei 397 nm und auch den Hintergrund bei 450 nm zu erfassen.

Bandbreite (Spaltgröße): Die HORIBA-Methode verwendet einen 5-nm-Bandpass Schlitze sowohl am Anregungs- als auch am Emissionsspektrometer. Einige Hersteller spezifizieren 10-nm-Schlitze, was die Empfindlichkeit im Vergleich zu 5 nm erhöht. Es wurde berichtet, dass eine Verdoppelung der physikalischen Spaltgröße am Eingang und Ausgang eines Monochromators die Intensität der Anregung und den Emissionserfassungsdurchsatz vervierfachen kann, da der Durchsatz mit dem Quadrat der Größenzunahme steigt. Dies ist jedoch eine vereinfachende Schätzung, die gemessen werden sollte empirisch. HORIBA hat den Faktorunterschied zum HORIBA Fluoromax gemessen und festgestellt, dass bei Fluoromax durch Verdoppelung der Spaltgröße von 5 auf 10 nm das Gesamtsignal-Rausch-Verhältnis für das Raman-Wasserband um mehr als das Dreifache erhöht wird. Dies ist jedoch für alle Fluorometer unterschiedlich. Vergleichen Sie daher unbedingt mit identischen Bandpässen.

Integrationszeit (oder Reaktionszeit): Dies bezieht sich darauf, wie lange der Detektor bei einem bestimmten Wert ein Signal erfassen darf Wellenlängenschrittposition. Es spielt auch eine bedeutende Rolle bei der für ein Fluorometer gemessenen Gesamtempfindlichkeit. Das HORIBA-Verfahren verwendet eine Integrationszeit von 1 Sekunde an jedem Wellenlängenpunkt, ähnlich wie bei anderen Herstellern. Einige Hersteller geben jedoch eine Reaktionszeit von 2 Sekunden an, die das Signal-Rausch-Verhältnis insgesamt um fast den Faktor zwei erhöht. Stellen Sie sicher, dass Sie beim Vergleich dieselbe Integrations- (Reaktions-) Zeit verwenden.

PMT-Typ: Die meisten Spektrofluorometer verwenden eine Fotovervielfacherröhre (PMT) als einzigen Detektor für die Fluoreszenzemission, ohne dass das Detektorgehäuse gewechselt werden kann. Dies gilt für die meisten analytischen Tischfluorometer. Einige dieser Tischsysteme ermöglichen die Auswahl verschiedener einzelner PMTs mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen und Spezifikationen. PMTs, die nicht so weit im NIR detektieren wie andere PMTs, weisen eine geringere Dunkelzahl auf, so dass sie ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis im Bereich von 350 bis 400 nm liefern, jedoch möglicherweise nicht für die gesamte Emissionswellenlänge verwendbar sind Bereich für ein bestimmtes Labor gewünscht. Das Standard-PMT von HORIBA, das in den Fluorometern der Serien FluoroMax Plus, Fluorolog3 und QuantaMaster 8000 verwendet wird, ist das PMT Hamamatsu R928P, das als Industriestandard für Fluorometer gilt. Stellen Sie in diesen Fällen sicher, dass jedes Fluorometer nach Möglichkeit dieselbe PMT verwendet.

Optische Filter: Dem optischen Pfad eines Fluorometers kann entweder auf der Anregungs- oder der Emissionsseite ein optischer Filter hinzugefügt werden der Probe. Diese können manuell in einen Filterhalter im Probenraum eingesetzt werden oder Teil eines Filterrads sein, das bei Auswahl verschiedener Versuchsprotokolle automatisch verschiedene Filter in den Strahlengang einführt. Optische Filter haben den Effekt, die Streulichtunterdrückung bei bestimmten Wellenlängen zu verbessern, und sie können das Signal-Rausch-Verhältnis eines Fluorometers dramatisch verbessern. HORIBA verwendet keine anderen optischen Filter als die Abtastspektrometer selbst, wenn das SNR für Wasser-Raman mit den Spezifikationen der Serien Fluoromax, Fluorolog3 oder QuantaMaster 8000 angegeben wird.Wenn Sie ein HORIBA-Fluorometer mit einem Fluorometer vergleichen, das automatisierte Filter verwendet, verwenden Sie bitte keinen Filter. Wenn dieser automatisch ist, bestätigen Sie, welche Marke und welcher Filtertyp verwendet werden und wo sie verwendet werden, um eine ähnliche experimentelle Methode zu replizieren ein HORIBA-Fluorometer.

Anwendbar für modulare Forschungsfluorometer

Detektortyp: Modulare Forschungsfluorometer enthalten normalerweise standardmäßig ein PMT-Gehäuse, ermöglichen jedoch viele verschiedene Typen von Einkanaldetektoren, um die Wellenlänge zu verlängern Bereich oder Fluoreszenzlebensdauerbereich eines Instruments. Alternative Detektoren umfassen gekühlte PMT-Gehäuse, verschiedene Festkörperdetektoren wie InGaAs, MCP-PMTs usw. Diese verschiedenen Detektortypen haben dramatische Auswirkungen auf das Signal-Rausch-Verhältnis einer bestimmten Probenmessung. Wenn Sie also auch hier versuchen, die Empfindlichkeit eines Fluorometers mit einem anderen zu vergleichen, stellen Sie sicher, dass für die Datenerfassung derselbe Detektortyp verwendet wird beide Systeme.

Detektortemperatur: Die meisten kommerziellen Spektrofluorometer verwenden PMT-Gehäuse, die nicht gekühlt sind, und tatsächlich bieten viele Instrumente nicht einmal eine gekühlte Detektoroption an. Ein gekühltes PMT-Gehäuse kann die Empfindlichkeit eines Instruments verbessern, indem die Dunkelzahlen (Hintergrund) im Vergleich zu genau demselben PMT in einem Umgebungsgehäuse verringert werden. Die Standard-PMT-Gehäuse von HORIBA in FluoroMaxPlus, Fluorolog3 und QuantaMaster 8000 sind PMT-Umgebungsgehäuse. Die Serien Fluorolog3 und QuantaMaster 8000 bieten jedoch optional gekühlte PMT-Gehäuse, um die Empfindlichkeit und die NIR-Erkennung zu verbessern. Vergleichen Sie beim Vergleich von modularen Forschungsfluorometern unbedingt die Daten, die mit demselben PMT-Gehäusetyp (Umgebungstemperatur oder gekühlt) erfasst wurden, und, falls gekühlt, auch auf dieselbe Temperatur gekühlt.

Einzel- und Doppelmonochromator: Modular Forschungsfluorometer ermöglichen es einem Forscher, einzelne oder doppelte Monochromatoren entweder auf dem optischen Weg der Anregung oder der Emission auszuwählen. Hier bezieht sich der Begriff Doppelmonochromator auf zwei nacheinander verteilende Gitterstufen mit einem Eintrittsspalt, einem Zwischenspalt und einem Austrittsspalt. Ein Doppelmonochromator kann entweder im additiven oder im dispersiven Modus konfiguriert werden. In beiden Fällen unterscheiden sich jedoch die Durchsatz- und Streulichtcharakteristika eines Einzelmonochromators im Vergleich zu einem Doppelmonochromator erheblich und haben einen großen Einfluss auf das SNR eines Wasser-Raman-Scans. Selbst wenn die Bandbreiten, Integrationszeiten und Wellenlängen konstant gehalten werden.

Rillendichte des Gitters: Die Rillendichte eines Gitters beeinflusst auch den Durchsatz und damit die Empfindlichkeit eines Spektrofluorometers. Für die meisten Spektrofluorometer ist dies kein allzu großes Problem, da die Systeme nur mit einem bestimmten Gitter hergestellt werden. In diesem Fall ist es am wichtigsten sicherzustellen, dass die Bandpässe gleich ausgewählt sind. Bei modularen Fluorometern können Sie die Monochromatoren jedoch mit unterschiedlichen Gittern oder mehreren Gittern konfigurieren. Bei diesen Systemen müssen Sie sehr vorsichtig sein, um die Dinge so ähnlich wie möglich zu halten. Wenn Sie beispielsweise zwei Instrumente mit ähnlichen Brennweiten-Spektrometern haben, wird durch Ändern der Rillendichte des Gitters die Empfindlichkeit für dieselbe 5-nm-Bandpasseinstellung erhöht oder verringert. Das HORIBA-Verfahren verwendet Gitter mit einer Rillendichte von 1.200 Rillen pro Millimeter.

Blaze-Winkel des Gitters: Die für einen Anregungs- oder Emissionsmonochromator ausgewählten Gitter bieten einen optimalen Durchsatz bei einem bestimmten Wellenlängenband, das als Blaze bezeichnet wird Winkel, da dies durch den Winkel des Gitterätzens bestimmt wird, der auf die Gitteroberfläche ausgeübt wird. Als solcher wäre ein Anregungsmonochromator mit einem 350 nm-Blaze-Anregungsmonochromator und einem 400 nm-Emissionsmonochromator die optimale Wahl, um die beste Wasser-Raman-Empfindlichkeit bei Anregung bei 350 nm zu erzielen. Da Sie bei den meisten Fluorometern das Gitter nicht einstellen können, ist diese Variable kein Faktor. Für diejenigen, bei denen Sie Gitter auswählen können, müssen Sie jedoch Gitter mit demselben oder einem sehr ähnlichen Flammwinkel auswählen, um einen gültigen Vergleich durchzuführen .