Úvod

Horizontální přenos genů (HGT) mezi bakteriálními buňkami přispívá k adaptaci bakterií na různá prostředí a z dlouhodobého hlediska k evoluci bakterií (Lorenz a Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas a Nielsen, 2005). V lidských podmínkách však způsobuje nežádoucí šíření patogenity, rezistence vůči antibiotikům nebo uměle vytvořených genů (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Obecně jsou přijímány tři mechanismy HGT v bakteriích: konjugace, transdukce a transformace (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Konjugace a transdukce zahrnují specifický aparát pro přenos DNA z dárce do buňky příjemce; jedná se o konjugativní pili a fágové viriony. Transformace je primárně funkcí buněk příjemce, které vyjadřují schopnost přijímat extracelulární nahou DNA.

Transformační schopnost může být indukována přirozeně nebo uměle, ale ne všechny bakteriální druhy si přirozenou kompetenci rozvíjejí (Lorenz a Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). U přirozeně transformovatelných bakterií je kompetence obvykle přechodná a indukovaná změnami růstového stavu organismu (Johnston et al., 2014). Byla identifikována skupina „kompetenčních genů“ a byly navrženy obecné mechanické modely (Chen a Dubnau, 2004), ačkoli přesné mechanismy pro jednotlivé bakteriální druhy nebyly dostatečně objasněny (Cameron a Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz a Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska a Gerdes, 2015). Protože transformace vyžaduje extracelulární nahou DNA jako substrát, je při odlišení transformace od ostatních klíčová citlivost na DNázu, která degraduje nahou DNA. Mechanismy HGT rezistentní na DNázu (Lorenz a Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa a Berenguer, 2015).

Obecně Escherichia coli není považována za přirozeně transformovatelnou; vyvíjí vysokou genetickou kompetenci pouze za umělých podmínek, včetně vystavení vysokým koncentracím Ca2 + a teplotnímu šoku (Mandel a Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polyethylenglykol zacházet (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989) nebo elektrický šok (Sambrook a Russell, 2006). E. coli však údajně může vyjádřit skromnou kompetenci za určitých podmínek, které jsou proveditelné v jejím přirozeném prostředí (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . V následujícím textu definujeme transformaci, při které byl plazmid přidán externě jako plazmidová transformace (PT) a transformaci, kdy plazmidová DNA pochází z mrtvých bakteriálních buněk (z prostředí) jako horizontální přenos plazmidu transformací (HPTT).

Zdá se, že Escherichia coli má několik mechanismů absorpce DNA, včetně dvou populárních: jeden je závislý na „kompetenčních genech“, které běžně fungují u mnoha gramnegativních a pozitivních bakterií (Finkel a Kolter, 2001; Palchevskiy a Finkel, 2006; Sinha a kol., 2009; Sinha a Redfield, 2012; Seitz a Blokesch, 2013; Johnston a kol., 2014; Jaskólska a Gerdes, 2015) .Tento mechanismus je prováděn zejména specifickým molekulárním aparátem vytvořeným kolem buněčného povrchu Struktura, která prochází buněčnými membránami pouze lineární jednovláknovou DNA produkovanou pomocí specifické periplazmatické nukleázy. U E. coli se tyto geny nepovažují za přispívající k PT, protože PT vyžaduje absorpci intaktních dvojitých vázaná kruhová DNA (Sinha a Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Proto je nepravděpodobné, že by tento mechanismus přispíval k PT v životním prostředí. Druhým mechanismem je závislost na vnějších faktorech prostředí, jako jsou ionty dvojmocných kovů, tepelný šok a fyzické namáhání (Mandel a Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). O těchto podnětech se běžně uvažuje, že indukují tvorbu pórovitých struktur na buněčném povrchu pro průchod intaktní dvouvláknové DNA, včetně kruhových plazmidů, ačkoli podrobnosti zůstávají nejasné (Reusch et al., 1986; Reusch a Sadoff, 1988; Huang a Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Ionty Ca2 + a Mg2 + jsou nejtypičtějšími faktory vyvolávajícími kompetence. Environmentální stanoviště často obsahují několik milimolů těchto iontů, jejichž koncentrace jsou dostatečné k vyvolání slabé, ale zjistitelné kompetence v E. coli (Baur et al., 1996; Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Proto je tento mechanismus možný v prostředí mimo laboratoře. Kromě výše uvedených dvou mechanismů navrhli Sun et al. Další mechanismus. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) a Sun (2016), ve kterých je zahrnut transportér ABC a specifické periplazmatické a vnitřní membránové proteiny. Tento mechanismus je regulován interními transkripčními regulátory, RpoS a CRP, proto bylo navrženo, že tento mechanismus je také geneticky řízeným přirozeným procesem.

V tomto mini přehledu shrnujeme naše studie HGT s použitím E. coli experimentální systémy a diskutovat o možném výskytu transformace několika mechanismy v přirozeném prostředí a jejím možném dopadu na šíření genů rezistence na antibiotika.

Transformace E. coli plazmatem v podmínkách napodobujících přírodní prostředí

PT v extraktech potravin

Lidské potraviny jsou vynikajícími kultivačními médii pro mnoho bakterií. Malá pozornost však byla věnována účinkům potravin na bakteriální fyziologii kromě růstu a přežití. Zkoumali jsme možnost, že potraviny fungují jako média pro bakteriální transformaci. Potraviny často obsahují milimolární koncentrace dvojmocných kovových iontů (Ca2 + a Mg2 +) a jsou často skladovány v chladničce nebo mrazničce s následným rychlým ohřátím (tj. Tepelným šokem). Tyto podmínky vedou k rozvoji kompetence u E. coli (Mandel a Higa, 1970; Huang a Reusch, 1995; Baur a kol., 1996); protože E. coli je běžnou kontaminující látkou v potravinách, je zajímavé určit, zda ji lze transformovat v potravinách. Určité potraviny mohou skutečně působit jako média, která indukují kompetence u E. coli (Maeda et al., 2003). Ze 42 testovaných vzorků potravin > 10 vykazovalo schopnost vyvolat kompetenci na frekvenci 10–7−10−9. Mezi nimi supernatant z tofu (sýrová potravina vyrobená ze sraženého sójového mléka) vykazoval nejvyšší aktivitu (jedna z 10–7–10–8 buněk příjemce), což odpovídá přibližně polovině účinnosti dosažené při 100 mM CaCl2. Neexistovala však žádná jasná korelace mezi frekvencí transformace a chemickými vlastnostmi potravin (koncentrace Ca2 + nebo Mg2 + a pH), což naznačuje, že komplexní faktory v potravinách ovlivňují rozvoj kompetencí. Podobné účinky potravin na indukci transformace byly hlášeny u E. coli (Bauer et al., 1999) a Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT v Solid-Air Biofilm

Mnoho bakterií existuje jako biofilmy v přírodním a umělém prostředí (Davey a O’Toole, 2000). Biofilmy jsou agregáty mikrobů, které se tvoří na rozhraní tuhá látka-kapalina nebo tuhá látka vzduch (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Buňky v těchto kulturách s vysokou hustotou interagují navzájem a vyjadřují výrazné fyziologické funkce ve srovnání s jejich volnými formami planktonu. Předchozí studie týkající se transformace E. coli se výlučně zaměřovaly na planktonické buňky (Mandel a Higa, 1970; Hanahan, 1983), ale ukázali jsme, že buňky E. coli v biofilmech SA rozvíjejí kompetence na frekvenci 10−6−10−8 na různých pevná média, včetně LB a H2O agaru a různých vlhkých potravin (Maeda et al., 2004). Živé buňky obecně koexistují s mrtvými buňkami v biofilmech a tyto mohou uvolňovat svoji DNA a určité dvojmocné ionty kovů, včetně Ca2 + a Mn2 +, do místního mikroprostředí biofilmu (Davey a O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002. ). Tyto podmínky mohou být příznivé pro vývoj transformace a nemusí být výlučné pro biofilmy SA, protože bylo rovněž popsáno podobné zlepšení u vzduchových kapalných biofilmů E. coli (Król et al., 2011).

PT divokých kmenů E. coli ve vodě

Naše a další výsledky naznačují, že prostředí E. coli může potenciálně získat cizí DNA transformací. Existuje však několik předchozích zpráv o vyšetřování transformovatelnosti přírodních kmenů E. coli (Woegerbauer et al., 2002; Sinha a Redfield, 2012). Proto jsme zkoumali potenciál přírodních kmenů E. coli rozvíjet kompetence v podmínkách prostředí. Jako model přírodních E. coli (Ochman a Selander, 1984) jsme použili standardní kolekci referenčních kmenů E. coli (ECOR), protože tyto kmeny ECOR byly široce používány v různých studiích fyziologie, chování a genotypových variací přírodní E. coli (Tenaillon et al., 2010). Zjistili jsme, že některé kmeny ECOR vykazovaly zjistitelnou transformovatelnost (10–10–10–11) v přírodní vodě (komerčně dostupné lahvové přírodní čisté vody) při konstantních a měnících se teplotách mezi 5 a 35 ° C a při zimních teplotách v polním experimentu, což naznačuje že přírodní E. coli může potenciálně rozvíjet kompetenci za určitých podmínek, které by se mohly v prostředí reálně vyskytnout (Matsumoto et al., 2016b).

Horizontální přenos plazmidu transformací v E. coli

Freeze – Thaw-Induced HPTT in Natural Waters and Food Extracts

V prostředí může být nahá DNA přirozeně dodávána z mrtvých buněk do sousedních buněk ve stejném prostředí nebo mikroprostředí.Proto stojí za to prozkoumat možnost HPTT v uzavřeném systému za určitých proveditelných podmínek. Zmrazení a rozmrazení je běžný proces při zacházení s potravinami a vyskytuje se také v přírodě. Zpracování buněk E. coli zmrazením a roztátím může podporovat únik DNA z mrtvých buněk a následný příjem přežívajícími buňkami, protože reagují na tepelný šok, což vede k transformaci in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Toto ošetření kondenzovaných suspenzí smíšených kmenů E. coli v přírodních vodách a potravinových extraktech způsobilo in situ laterální přenos nekonjugativních plazmidů s frekvencí 10−8−10−10 (Ishimoto et al., 2008). K tomuto jevu došlo i po 1–2 měsících skladování při -20 ° C a jeho citlivost na DNázu prokázala, že byl zprostředkován transformačním mechanismem.

Nízká frekvence HPTT v SA Biofilms

Biofilmy jsou považovány za vhodné prostředí pro transformaci in situ, protože živé a mrtvé buňky koexistují v těsné blízkosti a DNA uvolněná z mrtvých buněk se často hromadí kolem živých buněk. Navíc, jak je popsáno výše, protože buňky E. coli mohou vyvinout skromnou kompetenci v SA biofilmech (Maeda et al., 2004), oba tyto faktory přispívají k HPTT v biofilmech. Jednoduchou kokultivací kmene bez plazmidu s kmenem nesoucím nekonjugativní plazmid v biofilmu SA na agarovém médiu bez antibiotik byly transformované buňky produkovány při nízké frekvenci (10−9−10−10) během 24–48 hodin (Maeda et al., 2006). Kapalné kultury stejných kmenů v LB bujónu neprodukovaly žádné nebo jen málo transformantů, což naznačuje důležitost tvorby SA biofilmu pro přenos plazmidu. Stejný jev se v zásadě vyskytl v SA biofilmech na médiích na bázi potravin (Ando et al., 2009). K tomuto jevu došlo také mezi populárními laboratorními kmeny, jako jsou DH5, HB101 a MG1655 (Etchuuya et al., 2011), které jsou lysogenní bez fágů a bez konjugačního aparátu, což naznačuje, že nízká frekvence horizontálního přenosu plazmidu v SA biofilmech může nastat bez pomoci fágového nebo konjugačního aparátu, a proto je tento přenos DNA způsoben jakousi transformací. Jelikož však mutace rpoS− tento HPTT neovlivnila (Maeda et al., 2006), mechanismus závislý na RpoS (Zhang et al., 2012) je nepravděpodobný.

Vysoká frekvence HPTT Indukováno P1 fágem

Vyhodnocením kombinací několika kmenů a plazmidů pro horizontální přenos plazmidu bylo zjištěno, že kmen E. coli CAG18439 působí jako dárce plazmidu i příjemce plazmidu v kombinaci s plazmidem pHSG299 a mohl často přenášet plazmid ve smíšené buněčné kultuře i v kapalném médiu (Etchuuya et al., 2011). Ukázalo se, že tento HGT je typem transformace, protože vysokofrekvenční přenos plazmidu (10 – 5 – 10 – 8) byl citlivý na DNázu. Další studie odhalily, že tento jev vykazuje některé specifické vlastnosti: (1) podpora proteinovým faktorem uvolněným z CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) propagace sekvencí 88 bp na pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) vysoká přenosová frekvence (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); a (4) závislost na specifických genech (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Pokud jde o (1), pozdější studie odhalila, že tyto proteinové faktory zahrnují fágovou část P1vir (nebo její derivát) a že externě přidaný P1vir fág může reprodukovat horizontální přenos plazmidu mezi buňkami E. coli a dalšími třemi hlavními rysy CAG18439 -závislá HPTT (Sugiura et al., 2017). Tento jev byl také do značné míry citlivý na DNázu, což naznačuje, že velká část tohoto přenosu plazmidu je způsobena transformací navzdory zapojení fága P1. Mechanismus transformace přenosu plazmidu indukovaného fágem Plvir může být způsoben fágovou infekcí nebo spontánním probuzením lysogenizovaného fága v buňkách nesoucích plazmidy, což vede k lýze buněk a následnému uvolnění intracelulární plazmidové DNA v použitelné formě pro transformaci. Ačkoli je takový mechanismus obecně proveditelný, došlo u E. coli k několika jasným demonstracím. Nedávná studie Keen et al. (2017) pomocí jiného fágového systému také demonstrovali podobný transformační mechanismus indukovaný fágem u E. coli. HPTT od P1vir nebo CAG18439 však nelze adekvátně vysvětlit pouze zvýšeným přísunem DNA z buněčné lýzy indukované fágem a liší se od jednoduché transformace v E. coli (Hanahan, 1983), pokud jde o její charakteristické vlastnosti (2–4). Pokud jde o (2), sekvence 88 bp na pHSG299 není homologní s částí sekvence genomu fága P1. Tato sekvence se často nachází v databázích mezi obecnými sekvencemi klonovacích vektorů, ale ne v žádném přirozeném zdroji. Při zpětném sledování konstrukčního procesu pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987) však máme podezření, že 88bp sekvence pochází z R6-5, a konjugativní R plazmid.Tato sekvence a podobné prvky DNA mohou přispívat k HPTT R a jiných plazmidů v prostředí. S ohledem na (3) nelze tento vysokofrekvenční přenos vysvětlit jednoduchou schopností PT CAG18439 a jiných použitých kmenů, protože jednoduchá PT u těchto kmenů za stejných kultivačních podmínek byla 105–102krát méně častá (Etchuuya et al., 2011). Bylo proto navrženo, aby se na podpoře HPTT mohl podílet také proteinový faktor odvozený od CAG18439 s velikostí odhadovanou mezi 9 a 30 kDa (Etchuuya et al., 2011). Tento faktor pravděpodobně napomáhá absorpci DNA buňkami příjemce, pravděpodobně v kombinaci se sekvencí 88 bp na transformující se DNA. A konečně, s ohledem na (4), pozdější screeningové studie pro celý genom pro geny příjemce zapojené do HPTT naznačují, že se mechanismu účastní více genů (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Patří mezi ně ty, u nichž nebylo hlášeno, že se účastní přirozené nebo umělé transformace v E. coli (jako je rodZ), a několik známých homologů genů kompetencí, jako jsou ybaV a yhiR (Finkel a Kolter, 2001; Palchevskiy a Finkel, 2006 ), ale nezahrnují rpoS a další geny související s mechanismem závislým na RpoS (Zhang et al., 2012). Celkově tyto výsledky ukazují na neznámý, komplexní mechanismus vysokofrekvenční HPTT indukované fágy, který může částečně sdílet cestu přirozené transformace.

HPTT mezi přirozenými kmeny E. coli

K dalšímu posouzení obecnosti a rozmanitosti HPTT u kmenů E. coli byly ve studii HPTT použity přírodní kmeny (výše zmíněné kmeny ECOR). Několik kombinací kmenů ECOR bylo společně kultivováno v kapalném médiu, což vedlo k horizontálnímu přenosu přirozených genů rezistence na antibiotika citlivých na DNázu (Matsumoto et al., 2016a, b). Izolace plazmidu z těchto nových transformantů prokázala horizontální přenos plazmidu mezi kmeny ECOR (Matsumoto et al., 2016a, b). Jednoduché experimenty PT za použití stejných kmenů ECOR odhalily, že HPTT se vyskytuje mnohem častěji (10–6–10–8) než jednoduché PT (pod 10–10) za stejných kultivačních podmínek, což naznačuje, že HPTT je jedinečný a efektivní. Navíc jsme zjistili, že 6 z 12 kombinací kmenů ECOR, z nichž některé neprodukují žádné plaky tvořící fágy (Shibata et al., 2014b), vykazovaly přenos genů citlivý na DNázu, což nás vedlo k podezření, že HPTT je v přirozených Kmeny E. coli. Celkově tato data naznačují, že u některých kmenů E. coli přirozeně existují také některé transformační mechanismy bez fágů a konjugace a že HPTT přírodních plazmidů rezistentních na antibiotika (jako jsou plasmidy kmene ECOR24: přístupová č. AB905284 a AB905285) může být cestou k produkci přírodních buněk E. coli rezistentních na více léčiv.

Možné mechanismy a proveditelnost PT a HPTT v E. coli v prostředí

Příklady PT a zmrazení a rozmrazení a nízkofrekvenční HPTT představené v tomto mini-přehledu pravděpodobně souvisejí spíše s mechanismem tvorby pórů než s mechanismem závislým na kompetenčních genech, protože potraviny a přírodní vody často obsahují hladiny mM iontů Ca2 + a Mg2 + (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003) a prostředí biofilmu dodává živým buňkám obsah mrtvých buněk, včetně dvojmocných kovových iontů a transformovatelné plazmidové DNA. Jak jsme popsali dříve (Maeda et al., 2006), biofilm SA (průměr 10–12 mm; tloušťka 0,5–0,8 mm) obsahuje přibližně 2–5 × 109 buněk. Kromě toho střevní bakterie u savců obecně dosahují přibližně 1011 buněk / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Vzhledem k obrovskému rozsahu prostředí nelze podceňovat ani frekvence transformace 10–9–10–10, protože budou mít dopad na populace bakterií.

Vysokofrekvenční HPTT popsaná v tomto článku může zahrnovat nejen mechanismus tvorby pórů, ale také část genových funkcí kompetence a případně další neznámý mechanismus, jak je uvedeno výše. Protože bakteriofágy jsou jedním z nejhojnějších organismů v biosféře a všudypřítomným v prostředí (Clokie et al., 2011), je fágem indukovaná HPTT rovněž považována za proveditelnou v prostředí, stejně jako běžná transdukce a další fágové deriváty způsoby HGT, např. agenti přenosu genů (Lang et al., 2012).

Závěr a perspektiva

Celkově naše výsledky a související předchozí data naznačují, že transformaci vyvolává více mechanismů – typ HGT v E. coli na základě různých environmentálních a buněčných okolností, jako je povaha média (např. voda a jídlo), proměnlivá teplota od mínus do -40 ° C, vysoká hustota buněk v biofilmech a různé genetické pozadí zúčastněných kmenů. Příspěvek HGT transformačního typu k genetické dynamice v prostředí může být podceňován (Bushman, 2002; Thomas a Nielsen, 2005) a naše studie naznačují, že HPTT u E.coli se vyskytuje při podstatných přenosových frekvencích (10−5−10−10) za podmínek, s nimiž se lze v prostředí realně setkat. Proto může HGT transformačního typu přispívat k šíření genů rezistence na antibiotika a vzniku bakterií rezistentních vůči více lékům v reálném prostředí mimo laboratoře. K pochopení přesné role a přínosu HGT transformačního typu při šíření rezistence na antibiotika jsou zapotřebí další studie.

Příspěvky autorů

HH, ES a SM napsali příspěvek.

Financování

Tuto práci podpořila společnost JSPS KAKENHI (grant # 25292051).

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděny při absenci jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být považovány za potenciální střet zájmů.

Poděkování

Jsme vděční společnosti Enago (www.enago.jp) za angličtinu editační a korekturní služby.