Experimentální metoda

Stejně jako vzorec použitý k výpočtu poměru signálu k šumu může mít dramatický vliv na zjevná citlivost jakéhokoli konkrétního spektrálního datového souboru, hardwarová konfigurace přístroje a experimentální parametry získávání dat mají také dramatický vliv na kvalitu získaného spektra.

Existuje mnoho hardwarových parametrů, nastavení a možnosti, které všechny mají vliv na měřenou citlivost spektrofluorometru. Díky tomu může být extrémně obtížné absolutně porovnat relativní citlivost dvou různých přístrojů, pokud nejsou použity prakticky stejným způsobem. Níže probereme každý z těchto faktorů a jejich dopad na výsledná data.

Použitelné pro všechny skenovací fluorometry

Excitační vlnová délka: Excitační vlnová délka by měla být stejná pro všechny porovnávané systémy. Metoda HORIBA používá pro Ramanovo pásmo vody excitaci 350 nm, stejně jako většina ostatních výrobců. Při excitaci při 350 nm má Ramanovo emisní pásmo pro vodu vrchol při 397 nm.

Je štěstí, že většina výrobců standardizovala tuto excitační vlnovou délku, protože umožňuje lepší srovnání. Je však naprosto platné přesunout excitační vlnovou délku na jakoukoli jinou hodnotu jako způsob testování citlivosti v jiném rozsahu vlnových délek (např. NIR).

Rozsah emisního skenování: Metoda HORIBA skenuje emisní monochromátor od 365 do 450 nm, s přírůstky 0,5 nm, aby se shromáždil celý Ramanův vrchol při 397 nm a také pozadí při 450 nm.

Šířka pásma (velikost štěrbiny): Metoda HORIBA používá pásmovou propust 5 nm štěrbiny na excitačním i emisním spektrometru. Někteří výrobci specifikují 10 nm štěrbiny, což má za následek zvýšení citlivosti ve srovnání s 5 nm. Bylo hlášeno, že zdvojnásobení fyzické velikosti štěrbiny na vstupu a výstupu z monochromátoru může čtyřnásobně zvýšit intenzitu buzení a propustnost detekce emisí, protože propustnost jde jako druhá mocnina zvětšení velikosti, ale toto je zjednodušující odhad, který by měl být měřen empiricky. Společnost HORIBA změřila rozdíl faktorů s přístrojem HORIBA Fluoromax a zjistila, že u přípravku Fluoromax zdvojnásobení velikosti štěrbin z 5 na 10 nm zvyšuje celkový poměr signálu k šumu pro Ramanovo pásmo vody více než třikrát. To se však bude u všech fluorometrů lišit, proto se nezapomeňte srovnávat se stejnými pásmovými propusti.

Čas integrace (nebo doba odezvy): To se týká toho, jak dlouho je detektoru povoleno shromažďovat signál v daném čase poloha kroku vlnové délky. Hraje také významnou roli v celkové citlivosti měřené na fluorometru. Metoda HORIBA používá 1 sekundový integrační čas v každém bodě vlnové délky, podobně jako u jiných výrobců. Někteří výrobci však určují dobu odezvy 2 sekundy, což zvyšuje celkový poměr signálu k šumu téměř dvojnásobně. Při porovnávání nezapomeňte použít stejnou dobu integrace (odezvy).

Typ PMT: Většina spektrofluorometrů používá jako jediný detektor fluorescenční emise fotonásobičovou trubici (PMT), bez možnosti výměny krytu detektoru. To platí pro většinu stolních analytických fluorometrů. Některé z těchto stolních systémů umožňují výběr různých jednotlivých PMT s různými rozsahy vlnových délek a specifikacemi. PMT, které nedetekují tak daleko do NIR jako ostatní PMT, budou mít nižší počet tmavých, takže budou poskytovat lepší poměr signálu k šumu v rozsahu 350 až 400 nm, avšak nemusí být použitelné v celé vlnové délce emise rozsah požadovaný pro konkrétní laboratoř. Standardní PMT společnosti HORIBA používaný v řadě fluorometrů FluoroMax Plus, Fluorolog3 a QuantaMaster 8000 je Hamamatsu R928P PMT, který je považován za průmyslový standard pro fluorometrii. V těchto případech se ujistěte, že každý fluorometr používá stejný PMT, pokud je to možné.

Optické filtry: K optické dráze fluorometru lze přidat optický filtr, a to buď na straně excitace, nebo na straně emise vzorku. Ty mohou být ručně umístěny do držáku filtru uvnitř komory na vzorky, nebo mohou být součástí filtračního kola, které může automaticky umístit různé filtry do optické dráhy, když jsou vybrány různé experimentální protokoly. Optické filtry mají za účinek zlepšení potlačení rozptýleného světla při daných vlnových délkách a mohou dramaticky zlepšit poměr signálu k šumu fluorometru. HORIBA nepoužívá žádné optické filtry, kromě samotných skenovacích spektrometrů, když specifikuje SNR pro vodní Raman se specifikacemi řady Fluoromax, Fluorolog3 nebo QuantaMaster 8000.Při porovnávání fluorometru HORIBA s fluorometrem, který používá automatické filtry, nepoužívejte filtr, nebo je-li automatický, ověřte, jaké značky a typy filtrů jsou použity a kde jsou použity, aby se replikovala podobná experimentální metoda s fluorometr HORIBA.

Použitelné pro modulární výzkumné fluorometry

Typ detektoru: Modulární výzkumné fluorometry standardně obsahují pouzdro PMT jako standard, ale umožňují mnoho různých typů jednokanálových detektorů pro prodloužení vlnové délky rozsah nebo doba životnosti fluorescence nástroje. Alternativní detektory zahrnují chlazené kryty PMT, různé detektory v pevné fázi, jako jsou InGaAs, MCP PMT a tak dále. Tyto různé typy detektorů budou mít dramatický vliv na poměr signálu k šumu jakéhokoli konkrétního měření vzorku, takže i zde se při pokusu o porovnání citlivosti jednoho fluorometru proti druhému ujistěte, že ke shromažďování údajů o oba systémy.

Teplota detektoru: Většina komerčních spektrofluorometrů používá pouzdra PMT, která nejsou chlazena, a mnoho přístrojů ve skutečnosti nenabízí ani možnost chlazeného detektoru. Chlazený kryt PMT může zlepšit citlivost nástroje snížením počtu tmavých (pozadí) ve srovnání se stejným přesným PMT v krytu prostředí. Standardní pouzdra PMOR společnosti HORIBA v přístrojích FluoroMaxPlus, Fluorolog3 a QuantaMaster 8000 jsou pouzdra okolního PMT, avšak řady Fluorolog3 a QuantaMaster 8000 nabízejí volitelně chlazená pouzdra PMT pro zlepšení citlivosti a detekce NIR. Při porovnávání modulárních výzkumných fluorometrů nezapomeňte porovnat údaje shromážděné se stejným typem pouzdra PMT (okolní nebo chlazené) a pokud je ochlazeno, pak také ochlazeno na stejnou teplotu.

Single Versus Double Monochromator: Modular výzkumné fluorometry umožňují výzkumnému pracovníkovi vybrat jednoduché nebo dvojité monochromátory buď na excitační nebo emisní optické cestě. Pojem dvojitý monochromátor zde označuje dva disperzní stupně mřížky, jeden po druhém, se vstupní štěrbinou, střední štěrbinou a výstupní štěrbinou. Dvojitý monochromátor lze konfigurovat buď v aditivním nebo disperzním režimu, ale v obou případech jsou charakteristiky propustnosti a rozptýleného světla jednoho versus dvojitého monochromátoru výrazně odlišné a budou mít velký dopad na SNR vodního Ramanova skenování, i když jsou šířky pásma, integrační časy a vlnové délky udržovány konstantní.

Hustota drážky mřížky: Hustota drážky mřížky také ovlivní propustnost a tím i citlivost spektrofluorometru. Pro většinu spektrofluorometrů to není příliš velký problém, protože systémy jsou vyráběny pouze s jednou konkrétní mřížkou. V tomto případě je nejdůležitější zajistit, aby pásmová propust byla vybrána jako stejná. U modulárních fluorometrů však můžete konfigurovat monochromátory s různými mřížkami nebo více mřížkami. U těchto systémů musíte být velmi opatrní, abyste udrželi věci co nejpodobnější. Například pokud máte dva přístroje, které mají podobné spektrometry s ohniskovou vzdáleností, změnou hustoty drážky mřížky se zvýší nebo sníží citlivost pro stejné nastavení pásmového pásma 5 nm. Metoda HORIBA používá mřížky s hustotou háje 1 200 drážek na milimetr.

Blaze Angle of Grrating: Mřížky vybrané pro excitační nebo emisní monochromátor poskytují optimální propustnost v konkrétním pásmu vlnových délek, označovaném jako blaze úhel, protože tento je určen úhlem leptání mřížky uděleným na povrchu mřížky. Jako takový by byl excitační monochromátor s 350 nm zářeným excitačním monochromátorem a 400 nm emisním monochromátorem optimální volbou pro dosažení nejlepší vodní Ramanovy citlivosti při excitaci při 350 nm. Protože většina fluorometrů vám neumožňuje nastavit mřížku, tato proměnná není faktorem, ale pro ty, které vám umožňují zvolit mřížky, nezapomeňte zvolit mřížky se stejným nebo velmi podobným úhlem zážehu, abyste provedli platné srovnání .