Abstrakt

TP53, kódující p53, je jedním z nejznámějších genů potlačujících nádor. Většina lidských rakovin demonstruje inaktivaci dráhy p53. Mutantní p53 nejenže již nefunguje jako supresor nádoru, ale může také vykazovat účinky podporující nádor. Základní funkcí p53 je reagovat na buněčný stres. Přezkoumáme zde nedávný pokrok ve výzkumu p53 a zaměříme se na apoptózu, zastavení buněčného cyklu a stárnutí v reakci na stres. Rovněž zkoumáme klinické aplikace léčby rakoviny u lidí na základě p53.

1. Úvod

Gen TP53, který kóduje p53, je jedním z nejčastěji mutovaných genů u lidských rakovin. Uvádí se, že přibližně polovina všech druhů rakoviny inaktivovala p53. Protein p53 má širokou škálu biologických funkcí, včetně regulace buněčného cyklu, apoptózy, stárnutí, metabolismu DNA, angiogeneze, buněčné diferenciace a imunitní odpovědi. Mnoho publikací uvádí různé funkce p53, včetně transkripčních, posttranskripčních a posttranslačních rolí.

V tomto článku se zaměříme na problémy týkající se p53 a aplikace léčby rakoviny založené na p53. Jak hodnotili Vousden a Prives, hlavními funkcemi p53 jsou regulace zastavení růstu a apoptózy.

2. Normální funkce p53

Četné studie prokázaly, že p53 je transkripční faktor, který se zaměřuje na mnoho genů a mikroRNA v reakci na stres ve sklepě. Klíčovou rolí p53 jako supresoru nádoru je blokovat progresi buněčného cyklu a / nebo vyvolat apoptózu v reakci na buněčné stresy, jako je poškození DNA. Zhoršená aktivita p53 podporuje akumulaci poškození DNA v buňkách, což vede k fenotypu rakoviny. Jako transkripční faktor tvoří p53 rozmanitou a komplexní regulační síť genů. Bylo provedeno rozsáhlé vyšetřování k objasnění cílových sekvencí, které p53 rozpoznává, elementu odpovědi p53 (RE), jak nedávno přezkoumali Riley et al. p53 má velmi širokou škálu biologických aktivit, proto se tento přehled zaměří na roli p53 jako tumor supresoru a jeho důsledky pro terapii rakoviny.

2.1. Lidské rakoviny a mutace p53

Frekvence mutací TP53 se pohybuje od ~ 10% (hematopoetické malignity) do 50–70% (vaječníky, kolorektální karcinomy a malignity hlavy a krku). Germline mutace TP53 způsobuje syndrom Li-Fraumeni, což je familiární syndrom rakoviny, včetně rakoviny prsu, sarkomu měkkých tkání a různých dalších typů rakoviny. Většina mutací TP53 u lidských rakovin vede k mutacím v doméně vázající DNA, což brání p53 v přepisu cílových genů. Mutantní p53 však vedl nejen ke ztrátě normální funkce proteinu divokého typu, ale také k novým schopnostem podporovat rakovinu. První zprávou o tomto zvýšení funkce mutantním p53 bylo pozorování, že transfekce mutantního p53 do buněk bez p53 zvyšuje tvorbu nádoru u myší. Četné následné studie toto zjištění potvrdily.

2.2. p53 jako tumor supresor

2.2.1. p53 jako senzor poškození DNA

Genetická nestabilita je jedním z nejvýznamnějších rysů maligních nádorů. Existují velmi propracované systémy pro detekci poškození DNA a opravu genomu. p53 hraje důležitou roli v takových „domovnických“ systémech. Když p53 reaguje na poškození DNA, vyvolává buď zastavení buněčného cyklu nebo apoptózu.

V roce 1991 se ukázalo, že indukce divokého typu p53 může vyvolat apoptózu v leukemických buňkách. Myši, které mají specifický mutant p53, nemají schopnost indukovat zástavu buněčného cyklu, ale zachovávají si schopnost indukovat apoptózu, což jim umožňuje účinně potlačovat nádory vyvolané onkogenem, což naznačuje, že proapoptotická funkce p53 může hrát více hraje důležitou roli v jeho protinádorových účincích než v indukci zástavy buněčného cyklu.

2.2.2. p53 a apoptóza

V řadě zpráv je popsán mechanismus, kterým p53 indukuje apoptózu. funguje hlavně jako transkripční faktor, je důležité prozkoumat geny regulované p53, které přispívají k regulaci apoptózy. Dřívější studie ukázaly, že divoký p53 může vázat oblast promotoru genu bax a regulovat transkripci genu bax. bax je členem Bc Rodina l-2, která tvoří heterodimery s Bcl-2, inhibuje jeho aktivitu. Rodina proteinů Bcl-2 hraje důležitou roli při apoptóze a rakovině. Například Bcl-2 řídí uvolňování cytochromu c z mitochondrií, které aktivuje apoptotickou dráhu aktivací kaspázy 9. Kaspáza 9 poté aktivuje exekutivní kaspázu 3. Obě kaspázy hrají klíčové role v apoptotické dráze.

Několik lidských rakovin, včetně rakoviny tlustého střeva a žaludku, změnilo expresi Bcl-2. Význam úrovně exprese Bcl-2 pro prognózu onkologických pacientů je však stále zkoumán.Příspěvek exprese baxu k prognóze onkologických pacientů a odpovědi na léčbu je také nejasný. U rakoviny prsu studie ukázala, že nízká úroveň exprese baxu je spojena se špatnou prognózou, zatímco jiné zprávy neukázaly žádnou korelaci mezi úrovní exprese baxu a prognózou. Bude proto nutný další výzkum.

CD95 (také nazývaný Fas a Apo-1) je „receptor smrti“, což naznačuje jeho hlavní roli v apoptóze. První zpráva o CD95 ukázala, že anti-CD95 protilátka snížila růst nádorů xenoimplantátu lidských B-buněk. Od té doby byly publikovány četné zprávy o signální dráze indukované CD95 v apoptóze. Cytotoxická činidla, jako jsou chemoterapeutická léčiva, mohou indukovat apoptózu v buňkách citlivých na léčivo. objasnit, které signální dráhy se nejvíce podílejí na apoptóze. Vysvětlení těchto informací by bylo užitečné při objevování léků.

Několik zpráv naznačuje, že dráha CD95 hraje důležitou roli v apoptóze vyvolané cytotoxickými látkami a že tento systém zahrnuje aktivaci divokého typu p53. Proto může stav p53 ovlivňovat chemosenzitivitu prostřednictvím signalizace CD95. Nedávná zpráva však naznačila, že CD95 může podporovat růst nádoru. Programovaná buněčná smrt je velmi komplikovaná d a závisí na řadě faktorů.

Existuje podrodina Bcl-2, která obsahuje pouze doménu BH3. Bylo identifikováno několik proteinů obsahujících pouze BH3 a p53 působí jako transkripční faktor pro PUMA a NOXA, které oba patří do této třídy. PUMA je také klíčovým mediátorem apoptotické dráhy indukované p53.

Když je PUMA narušena v buňkách rakoviny tlustého střeva, je zabráněno apoptóze vyvolané p53. PUMA může hrát klíčovou roli při určování buněčného osudu (programovaná buněčná smrt versus zástava buněčného cyklu) v reakci na aktivaci p53. Zpráva o knockoutovaných myších PUMA ukázala, že knockout PUMA rekapituluje apoptotický nedostatek pozorovaný u p53 knockoutovaných myší. PUMA je nezbytným mediátorem apoptózy závislé a nezávislé na p53 in vivo. Protože vyhýbání se apoptóze je jedním ze znaků rakoviny, může PUMA hrát také důležitou roli během karcinogeneze.

Nedávné zprávy však ukázaly, že v určitých situacích může apoptóza podporovat karcinogenezi. Michalak a kol. a Labi a kol. ukázaly, že ztráta PUMA odstranila thymickou lymfomagenezi způsobenou gama zářením. Hematopoetické kmenové buňky s nedostatkem PUMA jsou chráněny před smrtí buněk indukovanou gama zářením, což snižuje kompenzační proliferaci a replikaci. Na druhou stranu, myši divokého typu zažívají masivní buněčnou smrt, když dostávají gama záření, což následně vedlo k repopulaci oblasti kmenovými / progenitorovými buňkami. Tyto zprávy naznačují, že struktura tkáně homeostázy / progenitoru může potlačovat tvorbu nádoru. Tento jev bude nutné potvrdit, ale měli byste na něj pamatovat při léčbě pacientů strategiemi, jako je chemoterapie nebo ozařování.

2.2.3. p53 a zadržování buněčného cyklu

Protein p53 potlačuje tvorbu nádoru nejen indukcí apoptózy, ale také tím, že způsobuje zastavení buněčného cyklu. V závislosti na typu buněčného stresu může p53 indukovat zástavu G1 aktivací transkripce inhibitoru cyklin-dependentní kinázy p21. Tento proces je dobře známý a byl rozsáhle studován. p53 také reguluje přechod G2 / M. Například p53 může blokovat vstup buněk do mitózy inhibicí Cdc2. Aby fungoval, musí se Cdc2 vázat na cyklin B1. Represe cyklinu B1 působením p53 také zastaví buňky v G2. Přechodný buněčný cyklus však nemusí vést k eradikaci nádoru, protože buňka s onkogenním potenciálem, kterou nelze opravit, může obnovit proliferaci.

Proto může v p53- hrát důležitou roli další mechanismus, buněčná stárnutí. zprostředkovaná suprese nádoru. Buněčná senescence je trvalé zastavení buněčného cyklu. Existuje mnoho zpráv týkajících se korelace mezi vývojem nádoru, p53 a stárnutím. Budeme diskutovat o několika z těchto faktorů z hlediska léčby rakoviny. Onkogenní ras exprimovaný v lidských a hlodavčích primárních buňkách vede k buněčné stárnutí. Tento proces je způsoben akumulací p53 a p16. Inaktivace p53 nebo p16 zabraňuje stárnutí vyvolané ras. Tato zpráva naznačuje, že stárnutí sklepa hraje důležitou roli při potlačení vývoje nádoru. Inaktivace p53, jak je přítomna u většiny lidských rakovin, umožňuje buňkám vyhnout se stárnutí ve sklepě, což vede k vývoji nádorů na makroúrovni.

Zdá se, že p53 také brání tomu, aby se premaligní léze vyvinuly do maligních nádorů aktivací programů stárnutí . Buněčná senescence indukovaná p53 je důležitá nejen pro prevenci rakoviny, ale také pro protirakovinový účinek vyvolaný jakýmkoli divokým typem p53 zavedeným do zavedených nádorů.

Xue et al. zkonstruoval myší model rakoviny jater s podmíněně regulovaným endogenním p53.Reaktivace endogenního p53 v p53-deficientních nádorech vede k úplné regresi nádoru. Zajímavé je, že primární odpovědí na p53 nebyla apoptóza, ale indukce programu stárnutí sklepa. Tento program spustil vrozenou imunitní odpověď, která eliminovala nádor z hostitele.

Zkontrolovali jsme dvě důležité role p53 jako supresoru nádoru. Mezi různými funkcemi p53 jsou hlavními mechanismy odpovědnými za jeho potlačení nádorů apoptóza a senescence. Stále však zbývá objasnit, jak přesně p53 určuje, zda dojde k aktivaci programu stárnutí nebo programu apoptózy. Tato otázka je zvláště důležitá pro vývoj léčby rakoviny založené na p53, včetně přístupů v kombinaci s konvenční chemoterapií. Většina konvenčních chemoterapeutických látek dosahuje eliminace rakovinných buněk jejich usmrcením. Pokud tedy p53 indukuje spíše stárnutí než apoptózu, objeví se konflikt. Ve skutečnosti bylo hlášeno, že některé typy rakoviny prsu jsou chráněny před cytotoxickými chemoterapeutiky endogenním p53.

Proto existuje řada faktorů, jako je kvalita a množství buněčného stresu, typ tkáně a mikroprostředí sklepa, určete osud buňky. Vousden a Prives navrhli model, kde rozhodnutí mezi životem a smrtí lze určit podle rozsahu poškození nebo doby trvání stresu. V jejich modelu nízká úroveň stresu, kterou lze opravit, vyvolává odpověď na opravu / přežití DNA, zatímco vysoká úroveň stresu, kterou nelze opravit, vyvolává apoptotickou nebo senescenční reakci. Tato dvojí povaha p53, zabijáka a ochránce, naznačuje možnost, že p53 může také působit jako promotor nádoru. Antiapoptotická funkce p53 může vést k přežití poškozených buněk, což může zvýšit možnost maligní transformace (obrázek 1).

Obrázek 1

Vousden a Prives navrhli model duálního mechanismu funkce p53 v nádorech. Výsledek aktivace p53 závisí na více proměnných. V tomto modelu vede reakce p53 na nízký stres k zastavení buněčného cyklu, inhibici růstu, opravě DNA atd. Tato reakce umožňuje buňkám obnovit poškození vyvolané buněčným stresem. Ale když buňky dostávají vysoký stres, který nelze obnovit, působí p53 jako zabiják, který může vyvolat apoptózu nebo stárnutí a zabránit šíření vadných buněk. Pokud p53 omylem reaguje jako ochránce, když buňky dostávají vysoké napětí, které nelze opravit, buňky si zachovají genetické poškození, které může vést k rakovině nebo k ní přispívat (přerušovaná čára).

2.3. Aplikace léčby rakoviny založené na p53

Protože většina, ne-li všechny, lidské rakoviny skrývají pozměněný p53, je koncept obnovy p53 pro léčbu rakoviny velmi atraktivní. Zvířecí model ukázal reaktivaci divokého typu p53, která vedla k účinné regresi nádoru, včetně regrese lymfomu a jaterního karcinomu.

2.3.1. Reaktivace mutantu p53

Existuje třída malých molekul, které reaktivují funkce divokého typu mutantu p53. PhiKan083 je karbazolový derivát nalezený při screeningu krystalové struktury p53 in silico. Vazbou mutovaného p53 zvyšuje PhiKan083 teplotu tání mutovaného p53, což vede k reaktivaci jeho funkce. PRIMA-1 je další malá molekula identifikovaná buněčným screeningem, která obnovila sekvenčně specifickou vazbu DNA a aktivní konformaci p53. CP-31398 je také malá molekula, která může obnovit skládání proteinů mutovaného p53 na přirozenější konformaci, která umožňuje funkci divokého typu.

2.3.2. Stabilizace p53

MDM2 je ubikvitinová ligáza E3, která řídí degradaci p53. Mnoho nádorů nadměrně exprimuje MDM2, dokonce i nádory bez mutací p53. Cílení na MDM2 pro stabilizaci p53 se zdá být slibné, takže bylo publikováno mnoho zpráv o cílení na MDM2 nebo MDM2-p53.

Například nutliny jsou cis-imidazolinové sloučeniny, které působí jako antagonisté MDM2- interakce p53. Analýza krystalové struktury ukázala, že nutlin se váže v kapse MDM2, aby se zabránilo interakci p53-MDM2. Nutlin může aktivovat dráhu p53, čímž indukuje rakovinné buňky a xenoimplantátové nádory u myší, aby podstoupily zastavení buněčného cyklu, apoptózu a inhibici růstu.

MI-219 je další malá molekula, která inhibuje interakci MDM2-p53. MI-219 také aktivuje dráhu p53 v buňkách s p53 divokého typu. U nádorů xenoštěpu byla pozorována apoptóza a zástava buněčného cyklu, což vedlo k regresi nádoru.

Inhibice MDM2 a aktivace p53 v normální tkáni však mohou být škodlivé. Ringshausen et al. ukázaly, že p53 je spontánně aktivován v mnoha tkáních u myší s deficitem MDM2.Navíc p53 spustil smrtelné patologie, které zahrnovaly ablaci klasicky radiosenzitivních tkání.

2.3.3. Další třídy léků pro stabilizaci p53

Podle buněčného screeningu drog byl tenovin aktivován p53. Tenovin působí jako inhibitor protein-deacetylačních aktivit SirT1 a SirT2. Bylo prokázáno, že intraperitoneální podávání tenovinu-6 indukuje regresi xenograftových nádorů v myším režimu.

Issaeva a kol. prověřil chemickou knihovnu a našel malou molekulu RITA (reaktivace p53 a indukce apoptózy nádorových buněk), která se váže na p53 a inhibuje interakci p53-MDM2 jak in vitro, tak in vivo. RITA vyvolala apoptózu v různých rakovinných buňkách, které si zachovaly divoký typ p53. Zjistili také, že p53 uvolněný z MDM2 společností RITA podporuje p21 a hnRNP K (kofaktor p53), což znamená, že p21 hraje hlavní roli v regulaci osudu rakovinných buněk po reaktivaci p53 (obrázek 2).

Obrázek 2

Strategie pro Stabilizace p53 a reaktivace mutantního p53.

2.4. Inhibice p53 pro léčbu rakoviny

Inhibice p53 může chránit normální buňky během genotoxické chemoterapie nebo radiační terapie. Vedlejší účinky genotoxické léčby rakoviny jsou do značné míry způsobeny apoptózou zprostředkovanou p53. Malá molekula pifithrin-alfa může blokovat transkripční aktivitu závislou na p53 a chránit myši před smrtícími vedlejšími účinky spojenými s protinádorovou léčbou. Pokud se můžeme vyhnout genotoxickému stresu omezujícímu dávku na normální buňky během chemoterapie nebo radioterapie rakoviny, umožní to použití vyšší dávky u pacientů, kteří dostatečně nereagují na konvenční chemoterapii.

2.5. Genová terapie p53

První genová terapie založená na p53 byla popsána v roce 1996. Retrovirový vektor obsahující gen p53 divokého typu pod kontrolou promotoru aktinu byl injikován přímo do nádorů pacientů s malými buňkami s rakovinou plic . Po vývoji replikačně defektního rekombinantního viru p53 (Ad5CMV-p53) bylo provedeno mnoho klinických studií, včetně jednoho u pacientů s rakovinou jícnu. Několik pokusů dosáhlo fáze III, ale konečné schválení od FDA dosud nebylo uděleno. V poslední době se v Číně vyvíjí genová terapie založená na p53.

2.6. Imunoterapie založená na p53

S nádorem asociované antigeny specifické cytotoxické T lymfocyty mohou zprostředkovat imunitní odpověď hostitele proti rakovině in vivo. Protein P53, zejména zaměřený na missense mutaci p53, může být kandidátem nádorového antigenu. Někteří pacienti s rakovinou mají protilátky proti p53, frekvence a klinický význam jsou stále předmětem debaty.

Speetjens a kol. uvádějí klinické studie vakcíny syntetické s dlouhým peptidem (p53-SLP) specifické pro p53 u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem. Deset pacientů bylo očkováno p53-SLP ve studii fáze I a fáze II. Toxicita byla tolerovatelná a p53-specifická imunitní odpověď byla detekována u 9 z 10 pacientů. Reaktivita T-buněk specifických pro P53 přetrvávala déle než 6 měsíců u 6 z 9 pacientů. Ačkoli byla studie fáze I / II, může být obtížné dosáhnout klinického přínosu, protože většina pacientů měla pomocné T-buňky, které postrádaly klíčové cytokiny. Byla popsána předklinická studie fáze I / II s INGN-225 (Introgen), vakcínou dendritických buněk indukovanou adenovirem indukovanou p53 u pacientů s malobuněčným karcinomem plic (SCLC). INGN-225 byl dobře snášen a vyvolal p53-specifickou imunitní odpověď u 18/43 (41,8%) pacientů a senzibilizoval SCLC na následnou chemoterapii.

3. Závěr

V tomto článku jsme se zaměřili na funkce p53 a klinické aplikace zaměřené na p53 pro léčbu rakoviny. Navzdory nedávnému pokroku ve výzkumu cytoplazmatické funkce p53 se však zdá, že je třeba vyjasnit různé role, kromě jeho funkce jako jaderného faktoru. Bylo hlášeno, že p53 indukuje apoptózu nezávisle na transkripci genů již v roce 1994. Aktivovaný p53 překvapivě může indukovat apoptózu v cytoplazmě mechanismem závislým na baxu.

Tyto zprávy naznačují, že cytoplazmatický p53 může aktivovat apoptotický program nezávislý na transkripci. K využití této cytosolické funkce by proto měla být vyvinuta nová generace terapeutických přístupů k léčbě rakoviny na základě p53. To může být bezpečnější než regulace transkripční modulace divokého typu p53, která může vyvolat jak prožitkové, tak proapoptotické účinky na nádorové buňky, jak je uvedeno výše.

Nedávné zprávy ukázaly, že p53 reguluje proces vlastní obnova nervových kmenových buněk a hematopoetických kmenových buněk. Model rakovinových kmenů trvá na tom, že nádory jsou udržovány malou populací rakovinových kmenových buněk, které se mohou dělit symetricky i asymetricky. Ztráta p53 podporuje akutní myeloidní leukémii aberantní samoobnovou činností.

Bylo hlášeno, že prsní kmenové buňky s cílenou mutací p53 vykazují stejné vlastnosti jako rakovinné kmenové buňky. Reaktivace p53 obnovila asymetrické buněčné dělení rakovinných kmenových buněk a vyvolala inhibici růstu nádoru. Ve výsledku proto může být další zkoumání souvislosti mezi funkcí p53 a rakovinovými kmenovými buňkami jednou z nejdůležitějších oblastí výzkumu pro odhalování nových paradigmat v terapii rakoviny.