Introduktion

Horisontal genoverførsel (HGT) mellem bakterieceller bidrager til bakterietilpasning til forskellige miljøer og på lang sigt til bakteriel udvikling (Lorenz og Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas og Nielsen, 2005). I menneskelige miljøer forårsager det imidlertid uønsket spredning af patogenicitet, antibiotikaresistens eller kunstigt konstruerede gener (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Tre mekanismer for HGT i bakterier accepteres generelt: konjugation, transduktion og transformation (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Konjugering og transduktion involverer specifikt apparat til DNA-overførsel fra donor til modtagerceller; disse er henholdsvis konjugative pili- og fagvirioner. Transformation er primært en funktion af modtagerceller, der udtrykker kompetence til at optage ekstracellulært nøgent DNA.

Transformationskompetence kan være naturligt eller kunstigt induceret, men ikke alle bakteriearter udvikler naturlig kompetence (Lorenz og Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). I naturligt transformerbare bakterier er kompetence normalt forbigående og induceret af ændringer i organismens væksttilstand (Johnston et al., 2014). En gruppe af “kompetencegener” er blevet identificeret, og generelle mekanistiske modeller er blevet foreslået (Chen og Dubnau, 2004), skønt præcise mekanismer til individuelle bakteriearter ikke er belyst tilstrækkeligt (Cameron og Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz og Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska og Gerdes, 2015). Fordi transformation kræver ekstracellulært nøgent DNA som substrat, er følsomhed over for DNase, der nedbryder nøgent DNA, nøglen til at skelne transformation fra andre DNase-resistente HGT-mekanismer (Lorenz og Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa og Berenguer, 2015).

Generelt, Escherichia coli menes ikke at være naturligt transformerbar; det udvikler kun høj genetisk kompetence under kunstige forhold, herunder eksponering for høje Ca2 + koncentrationer og temperaturchok (Mandel og Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polyethylenglycol behandle ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989) eller elektrisk stød (Sambrook og Russell, 2006). Imidlertid kan E. coli efter sigende udtrykke beskeden kompetence under visse betingelser, der er mulige i dets naturlige miljøer (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . I det følgende definerer vi transformation, hvor plasmid blev tilsat eksternt som plasmidtransformation (PT), og transformation, hvor plasmid-DNA kommer fra døde bakterieceller (fra miljøet) som vandret plasmidoverførsel ved transformation (HPTT).

Escherichia coli ser ud til at have flere DNA-optagelsesmekanismer, herunder to populære: en, der er afhængig af “kompetencegener”, som almindeligvis virker i mange gramnegative og positive bakterier (Finkel og Kolter, 2001; Palchevskiy og Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha og Redfield, 2012; Seitz og Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska og Gerdes, 2015). Denne mekanisme udføres hovedsageligt af det specifikke molekylære apparat dannet omkring celleoverfladen struktur, der passerer gennem cellemembranerne kun lineært enkeltstrenget DNA produceret under anvendelse af en specifik periplasmisk nuklease. I E. coli anses disse gener ikke for at bidrage til PT, fordi PT kræver optagelse af intakte dobbelts overført cirkulært DNA (Sinha og Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Derfor er det usandsynligt, at denne mekanisme bidrager til PT i miljøet. Den anden mekanisme er den, der afhænger af eksterne miljøfaktorer, såsom divalente metalioner, varmechok og fysiske belastninger (Mandel og Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Disse stimuli anses almindeligvis for at inducere dannelsen af porelignende strukturer i celleoverfladen til passage af intakt dobbeltstrenget DNA, herunder cirkulære plasmider, skønt detaljerne forbliver uklare (Reusch et al., 1986; Reusch og Sadoff, 1988; Huang og Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Ca2 + og Mg2 + ioner er de mest typiske kompetencefremkaldende faktorer. Miljøhabitater indeholder ofte flere millimolære af disse ioner, hvis koncentrationer er tilstrækkelige til at inducere svag men påviselig kompetence i E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Derfor er denne mekanisme mulig i miljøet uden for laboratorier. Ud over de to ovennævnte mekanismer er en anden mekanisme blevet foreslået af Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) og Sun (2016), hvor en ABC-transportør og specifikke periplasmiske og indre membranproteiner er involveret. Denne mekanisme reguleres af interne transkriptionsregulatorer, RpoS og CRP, derfor blev det foreslået, at denne mekanisme også er en genetisk kontrolleret naturlig proces.

I denne mini-gennemgang opsummerer vi vores undersøgelser af HGT ved hjælp af E. coli eksperimentelle systemer og diskutere den mulige forekomst af transformation ved flere mekanismer i naturlige miljøer og dens mulige indvirkning på spredningen af antibiotikaresistensgener.

Plasmidtransformation af E. coli i forhold, der efterligner det naturlige miljø

PT i madekstrakter

Humane fødevarer er fremragende kulturmedier for mange bakterier. Imidlertid er der kun lidt opmærksomhed på virkningen af fødevarer på bakteriel fysiologi bortset fra vækst og overlevelse. Vi undersøgte muligheden for, at fødevarer fungerer som medier til bakteriel transformation. Fødevarer indeholder ofte millimolære koncentrationer af divalente metalioner (Ca2 + og Mg2 +) og opbevares ofte i køleskab eller fryser efterfulgt af hurtig opvarmning (dvs. varme chokeret). Disse betingelser er befordrende for udviklingen af kompetence i E. coli (Mandel og Higa, 1970; Huang og Reusch, 1995; Baur et al., 1996); fordi E. coli er en almindelig fødevareforurening, er det interessant at afgøre, om det kan transformeres i fødevarer. Visse fødevarer kan faktisk fungere som medier, der inducerer kompetence i E. coli (Maeda et al., 2003). Ud af 42 testede fødevareprøver viste > 10 en evne til at inducere kompetence med en frekvens på 10−7−10-9. Blandt disse udviste supernatanten fra tofu (en ostlignende mad fremstillet af ostemasse sojabønnemælk) den højeste aktivitet (en i 10-7-10-10 modtagerceller) svarende til ca. halvdelen af effektiviteten opnået med 100 mM CaCl2. Der var dog ingen klare sammenhænge mellem transformationsfrekvenser og kemiske egenskaber for fødevarer (Ca2 + eller Mg2 + koncentrationer og pH), hvilket tyder på, at komplekse faktorer inden for fødevarer påvirker kompetenceudvikling. Lignende virkninger af fødevarer til inducerende transformation er rapporteret i E. coli (Bauer et al., 1999) og Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT i Solid-Air Biofilm

Mange bakterier findes som biofilm i naturlige og kunstige miljøer (Davey og O’Toole, 2000). Biofilm er aggregater af mikrober, der dannes ved grænseflader med fast-væske eller fast luft (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Celler i disse kulturer med høj densitet interagerer med hinanden og udtrykker karakteristiske fysiologiske funktioner sammenlignet med deres frie planktoniske former. Tidligere undersøgelser af E. coli transformation fokuserede udelukkende på planktoniske celler (Mandel og Higa, 1970; Hanahan, 1983), men vi viste, at E. coli celler inden for SA biofilm udvikler kompetence med en frekvens på 10−6−10−8 på forskellige faste medier, herunder LB og H2O agar og forskellige fugtige fødevarer (Maeda et al., 2004). Levende celler eksisterer generelt sammen med døde celler i biofilm, og sidstnævnte kan frigive deres DNA og visse divalente metalioner, herunder Ca2 + og Mn2 +, i det lokale mikromiljø i biofilmen (Davey og O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Disse forhold kan være befordrende for udviklingen af transformation og er muligvis ikke eksklusive for SA biofilm, da en lignende forbedring i E. coli luft-flydende biofilm også er rapporteret (Król et al., 2011).

PT af vilde E. coli-stammer i vand

Vores og andres resultater antyder, at miljømæssige E. coli potentielt kan erhverve fremmed DNA via transformation. Der er dog få tidligere rapporter om undersøgelser af transformerbarheden af naturlige E. coli-stammer (Woegerbauer et al., 2002; Sinha og Redfield, 2012). Derfor undersøgte vi potentialet for naturlige E. coli-stammer til at udvikle kompetence under miljømæssige forhold. Vi brugte en standard E. coli-samling af referencestammer (ECOR) -stammer som vores model for naturlige E. coli (Ochman og Selander, 1984), fordi disse ECOR-stammer er blevet brugt i vid udstrækning i forskellige studier af fysiologi, adfærd og genotypisk variation af naturlig E. coli (Tenaillon et al., 2010). Vi fandt ud af, at nogle ECOR-stammer udviste påviselig transformerbarhed (10−10−10-11) i naturligt vand (kommercielt tilgængeligt naturligt rent vand på flaske) ved konstante og varierende temperaturer mellem 5 og 35 ° C og ved vintertemperaturer i et felteksperiment, hvilket tyder på at naturlig E. coli potentielt kan udvikle kompetence under visse betingelser, der muligvis kan forekomme i miljøet (Matsumoto et al., 2016b).

Horisontal plasmidoverførsel ved transformation i E. coli

Fryse-optø-induceret HPTT i naturlige vand og madekstrakter

I miljøet kan nøgen DNA naturligt tilføres fra døde celler til naboceller inden for samme habitat eller mikromiljø.Derfor er det værd at undersøge muligheden for HPTT i et lukket system under nogle mulige forhold. Frysning / optøning er en almindelig proces i håndteringen af fødevarer og forekommer også i naturen. Frys-tø-behandling af E. coli-celler kan fremme DNA-lækage fra døde celler og efterfølgende optagelse af overlevende celler, fordi de reagerer på varmechok, hvilket resulterer i transformation in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Denne behandling af kondenserede suspensioner af blandede E. coli-stammer i naturligt vand og madekstrakter forårsagede in situ lateral overførsel af ikke-konjugative plasmider med en frekvens på 10−8−10-10 (Ishimoto et al., 2008). Dette fænomen opstod også selv efter 1-2 måneders opbevaring ved -20 ° C, og dets følsomhed over for DNase viste, at det blev medieret via en transformationsmekanisme.

Lav frekvens af HPTT i SA Biofilms

Biofilm menes at være egnede miljøer til in situ transformation, fordi levende og døde celler eksisterer tæt sammen, og DNA frigivet fra døde celler ofte akkumuleres omkring levende celler. Desuden, som beskrevet ovenfor, fordi E. coli celler kan udvikle beskeden kompetence i SA biofilm (Maeda et al., 2004), bidrager begge disse faktorer til HPTT i biofilm. Ved simpelthen at dyrke en plasmidfri stamme med en, der huser et ikke-konjugativt plasmid i en SA-biofilm på antibiotikafri agarmedier, blev transformerede celler produceret ved lav frekvens (10−9−10-10) inden for 24-48 timer (Maeda et al., 2006). Flydende kulturer af de samme stammer i LB-bouillon producerede ingen eller få transformanter, hvilket tyder på betydningen af SA-biofilmdannelse for plasmidoverførsel. I det væsentlige forekom det samme fænomen i SA biofilm på fødevarebaserede medier (Ando et al., 2009). Dette fænomen forekom også mellem populære laboratoriestammer som DH5, HB101 og MG1655 (Etchuuya et al., 2011), som er lysogene fagfrie og konjugative apparaturfrie, hvilket antyder, at den lave frekvens af vandret plasmidoverførsel i SA biofilm kan forekomme uden hjælp fra fag- eller konjugeringsmaskineri og derfor, at denne DNA-overførsel skyldes en slags transformation. Da rpoS- mutation ikke påvirkede denne HPTT (Maeda et al., 2006), er den RpoS-afhængige mekanisme (Zhang et al., 2012) sandsynligvis ikke involveret.

Høj frekvens af HPTT Fremkaldt af P1-fag

Ved at vurdere kombinationer af flere stammer og plasmider til vandret plasmidoverførsel, viste det sig, at E. coli-stammen CAG18439 fungerede som både en plasmid-donor og en plasmidmodtager i kombination med plasmidet pHSG299 og kunne ofte overføre plasmidet i en blandet cellekultur selv i et flydende medium (Etchuuya et al., 2011). Denne HGT blev påvist at være en type transformation, fordi højfrekvent plasmidoverførsel (10-5-10-8) var DNase-følsom. Yderligere undersøgelser afslørede, at dette fænomen udviser nogle specifikke karakteristika: (1) forfremmelse med proteinholdig faktor frigivet fra CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) forfremmelse med en 88-bp sekvens på pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) høj overførselsfrekvens (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); og (4) afhængighed af specifikke gener (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Med hensyn til (1) afslørede en senere undersøgelse, at disse proteinholdige faktorer inkluderer en P1vir-fagpartikel (eller et derivat deraf), og at eksternt tilsat P1vir-fag kan reproducere vandret plasmidoverførsel mellem E. coli-celler og de tre andre hovedtræk ved CAG18439 -afhængig HPTT (Sugiura et al., 2017). Dette fænomen var også stort set DNase-følsomt, hvilket antyder, at en stor del af denne plasmidoverførsel skyldes transformation på trods af involvering af P1-fag. Transformationsmekanismen for P1vir-faginduceret plasmidoverførsel kan skyldes faginfektion eller spontan opvågning af lysogeniseret fag i plasmid-husende celler, hvilket fører til cellelyse og efterfølgende intracellulær plasmid-DNA-frigivelse i en anvendelig form til transformation. Selvom en sådan mekanisme generelt er mulig, har der været få klare demonstrationer af den i E. coli. En nylig undersøgelse foretaget af Keen et al. (2017) ved anvendelse af andet fagsystem demonstrerede også en lignende faginduceret transformationsmekanisme i E. coli. Imidlertid kan HPTT af P1vir eller CAG18439 ikke kun forklares tilstrækkeligt ved forbedret DNA-tilførsel fra faginduceret cellelyse, og det adskiller sig fra simpel transformation i E. coli (Hanahan, 1983) med hensyn til dets karakteristiske egenskaber (2-4). Med hensyn til (2) er 88-bp-sekvensen på pHSG299 ikke homolog med den del af P1-faggenomsekvensen. Denne sekvens findes ofte i databaser blandt generelle kloningsvektorsekvenser, men ikke i nogen naturlig kilde. Ved at spore byggeprocessen af pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), formoder vi imidlertid, at 88-bp sekvensen stammer fra R6-5, en konjugativt R-plasmid.Denne sekvens og lignende DNA-elementer kan bidrage til HPTT af R og andre plasmider i miljøet. Med hensyn til (3) kan denne højfrekvente overførsel ikke forklares med den enkle PT-evne for CAG18439 og andre anvendte stammer, fordi simpel PT i disse stammer under den ækvivalente kulturbetingelse var 105-102 gange mindre hyppig (Etchuuya et al., 2011). Det blev derfor foreslået, at en CAG18439-afledt proteinholdig faktor med størrelse estimeret mellem 9 og 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) også kunne være involveret i at fremme HPTT. Denne faktor hjælper formodentlig ved DNA-optagelse af modtagerceller, sandsynligvis i kombination med 88-bp sekvensen på transformerende DNA. Til sidst, med hensyn til (4), foreslog senere genomomfattende screeningsundersøgelser for modtagergener involveret i HPTT, at flere gener deltog i mekanismen (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Disse inkluderer dem, der ikke er rapporteret at være involveret i naturlig eller kunstig transformation i E. coli (såsom rodZ) og et par kendte kompetencegenhomologer, såsom ybaV og yhiR (Finkel og Kolter, 2001; Palchevskiy og Finkel, 2006 ), men inkluderer ikke rpoS og andre gener relateret til den RpoS-afhængige mekanisme (Zhang et al., 2012). Samlet set peger disse resultater mod en ukendt, kompleks mekanisme af faginduceret, højfrekvent HPTT, der delvist kan dele vejen for naturlig transformation.

HPTT mellem naturlige E. coli-stammer

For yderligere at vurdere generaliteten og variationen af HPTT i E. coli-stammer blev naturlige stammer (de førnævnte ECOR-stammer) anvendt i en undersøgelse af HPTT. Flere kombinationer af ECOR-stammer blev kultiveret i flydende medier, hvilket resulterede i DNase-følsom vandret overførsel af naturlige antibiotikaresistensgener (Matsumoto et al., 2016a, b). Plasmidisolering fra disse nye transformanter viste vandret plasmidoverførsel mellem ECOR-stammer (Matsumoto et al., 2016a, b). Enkle PT-eksperimenter, der bruger de samme ECOR-stammer, afslørede, at HPTT forekommer meget oftere (10-6-10-8) end simpel PT (under 10-10) under de samme dyrkningsbetingelser, hvilket antydede, at HPTT er unik og effektiv. Desuden opdagede vi, at 6 ud af 12 kombinationer af ECOR-stammer, hvoraf nogle ikke producerer plaquedannende fager (Shibata et al., 2014b), udviste DNase-følsom genoverførsel, hvilket fik os til at mistanke om, at HPTT er ret almindelig i naturlig E. coli stammer. Samlet set tyder disse data på, at nogle fag- og konjugationsfri transformationsmekanismer også findes naturligt i nogle E. coli-stammer, og at HPTT af antibiotikaresistente naturlige plasmider (såsom plasmider af ECOR24-stammen: Adgangsnr. AB905284 og AB905285) kan være en vej til fremstilling af multilægemodstandsdygtige naturlige E. coli-celler.

Mulige mekanismer og gennemførlighed af PT og HPTT i E. coli i miljøet

Eksempler på PT og fryse-tø-induceret og lavfrekvent HPTT, der blev introduceret i denne mini-gennemgang, er sandsynligvis mere relateret til den poredannende mekanisme end den kompetente genafhængige mekanisme, fordi fødevarer og naturligt vand ofte indeholder mM-niveauer af Ca2 + og Mg2 + -ioner (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), og biofilmmiljøet forsyner levende celler med indholdet af døde celler, inklusive divalente metalioner og transformerbart plasmid-DNA. Som vi tidligere har beskrevet (Maeda et al., 2006), indeholder en SA biofilm (diameter 10-12 mm; tykkelse 0,5-0,8 mm) ca. 2-5 × 109 celler. Derudover udgør tarmbakterier i pattedyr generelt ca. 1011 celler / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). I betragtning af miljøets enorme skala kan selv transformationsfrekvenser på 10−9−10−10 ikke undervurderes, da de vil have en indvirkning på bakteriepopulationerne.

Højfrekvent HPTT beskrevet i denne artikel kan involvere ikke kun den poredannende mekanisme, men også en del af kompetencegenets funktioner og muligvis en anden ukendt mekanisme, som nævnt ovenfor. Fordi bakteriofager er en af de mest almindelige organismer i biosfæren og allestedsnærværende i miljøet (Clokie et al., 2011), anses faginduceret HPTT også for at være mulig i miljøet såvel som almindelig transduktion og anden fagafledt måder til HGT, f.eks. genoverføringsmidler (Lang et al., 2012).

Konklusion og perspektiv

Samlet set indikerer vores resultater og relaterede tidligere data, at flere mekanismer inducerer transformation- type HGT i E. coli baseret på forskellige miljømæssige og cellulære omstændigheder såsom mediets art (f.eks. vand og mad), variabel temperatur fra under nul til ~ 40 ° C, høj celletæthed i biofilm og varierende genetisk baggrund af de involverede stammer. Bidraget fra HGT af transformationstype til genetisk dynamik i miljøet kan undervurderes (Bushman, 2002; Thomas og Nielsen, 2005), og vores undersøgelser indikerer, at HPTT i E.coli forekommer ved betydelige overførselsfrekvenser (10-5-10-10) under de forhold, der muligvis kan opstå i miljøet. Derfor kan transformationstype HGT bidrage til spredningen af antibiotikaresistensgener og fremkomsten af multiresistente bakterier i det virkelige miljø uden for laboratorier. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå den nøjagtige rolle og bidraget til transformationstype HGT i spredning af antibiotikaresistens.

Forfatterbidrag

HH, ES og SM skrev papiret.

Finansiering

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Erklæring om interessekonflikt

Forfatterne erklærer, at forskningen var gennemført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kan fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Anerkendelser

Vi er taknemmelige over for Enago (www.enago.jp) for engelsk redigering og korrekturlæsningstjenester.