Toulouse-Lautrec besluttede at være maler og med støtte fra sin onkel Charles og flere familievenlige malere, som Princeteau, John Lewis Brown og Jean-Louis Forain, boede i Paris i 1881. Der var han elev af Léon Bonnat, som var en portrættegner, og da Bonnat-værkstedet lukkede i september 1882, måtte han kig efter en ny lærer, der var Fernand Cormon. I Cormons studie blev han venner med Vincent van Gogh.

I 1884 gik Toulouse-Lautrec for at bo i Montmartre-distriktet, hvor han havde naboer som Edgar Degas. Den fascination, han følte for natteliv, fik ham til at besøge dem regelmæssigt og blive en fast kunde hos nogle af dem, såsom Salon de la Rue des Moulins, Moulin de la Galette, Moulin Rouge, Le Chat Noir eller Folies Bergère : Alt relateret til denne verden, inklusive prostitution, var et af hovedtemaerne i hans arbejde. I sine værker fra Paris underverden malede han skuespillere, dansere, burgere og prostituerede. Han malede disse i sit daglige liv: mens de ændrede sig, når hver tjeneste var afsluttet, eller når de ventede på en lægekontrol.

I modsætning til impressionistiske kunstnere var han næppe interesseret i landskabsgenren og foretrukne miljøer. lukket, belyst med kunstigt lys, som tillod ham at lege med farver og rammer subjektivt. Meget opmærksom blev han tiltrukket af sangere og komikers bevægelser, og han kunne lide at latterliggøre hykleriet fra de magtfulde, der højlydt afviste de samme laster og miljøer, som de nød privat.

Ejerne af kabareter De bad ham om at tegne plakater for at promovere deres shows, noget som Lautrec var meget begejstret for, da han i løbet af sine lange nætter på disse steder tegnede alt, hvad han så, og efterlod det på bordene. I modsætning til den misforståede Vincent van Gogh solgte Toulouse-Lautrec endda værker og blev anerkendt, skønt hans popularitet lå i hans illustrationer til magasiner og reklameplakater mere end i oliemaleri.

Han havde store venner som danseren Jane Avril, til hvem hun dedikerede adskillige malerier og plakater. Han mødte kendte dansere som Valentín el Descoyuntado, klovne og andre figurer fra fester og shows i forstæderne. Denne verden af vice og ekstravagance var et fristed for Lautrec, der følte sig afvist af adelen, som han tilhørte af oprindelse. Hans handicap forårsagede afvisning i de smarte saloner, og i Montmartre kunne han gå ubemærket hen og frigøre sin bohemisme. Han kritiserede alle dem, der reflekterede landskaber i deres malerier, da han mente, at det, der virkelig var værd, var folket, folket. Han betragtede sig selv som en social kroniker, og han blandede, malede og var som folket. Han malede store værker som The Medical Inspection.

I 1886 forlod han Cormons atelier og lejede sit eget. I 1890’erne rejste han til London, hvor han mødte og portrætterede Oscar Wilde; Han designede også håndprogrammet (brochure eller pjece), der blev distribueret i den parisiske premiere på hans drama Salomé.

Han havde problemer med alkohol og fik også syfilis, hvilket ofte førte til galskab. Alkoholisme forværrede hans helbred, og fra 1897 led han af mani, depression og neurose såvel som lammelsesangreb i hans ben og på den ene side. I 1897 måtte han afhentes fra gaderne på grund af en berusethed, og kort tid efter kom han i en delirium tremens for at skyde på væggene i sit hus i tro på, at de var fulde af edderkopper. Alligevel fortsatte han med at male jævnt og hurtigt; men han blev hentet igen fuld i 1899 og indlagt på et mentalt hospital, hvor han lavede en samling malerier om cirkuset. De lod ham gå til sin mors hus i hendes ejendele nær Bordeaux, og den 9. september 1901 døde han sengeliggende.

I 1922 åbnede hans mor og hendes forhandler Toulouse-Lautrec-museet i Palacio de la Berbie. , Albi, meget besøgt og anerkendt for sin omfattende samling.