Eksperimentel metode

Ligesom den formel, der bruges til at beregne signal / støjforholdet, kan have en dramatisk effekt på tilsyneladende følsomhed af ethvert specifikt spektraldatasæt, instrumentets hardwarekonfiguration og de eksperimentelle parametre for dataopsamling har også en dramatisk effekt på kvaliteten af det erhvervede spektrum.

Der er mange hardwareparametre, indstillinger og indstillinger, som alle har en indvirkning på den målte følsomhed af et spektrofluorometer. Dette kan gøre det ekstremt vanskeligt absolut at sammenligne den relative følsomhed af to forskellige instrumenter, hvis de ikke anvendes på en næsten identisk måde. Nedenfor diskuterer vi hver af disse faktorer og den indvirkning, de har på de resulterende data.

Gælder for alle scanningsfluorometre

Excitationsbølgelængde: Excitationsbølgelængden skal være identisk for alle systemer, der sammenlignes. HORIBA-metoden bruger 350 nm excitation til Raman-båndet med vand, ligesom de fleste andre producenter gør. Når det er spændende ved 350 nm, har Raman-emissionsbåndet for vand en top ved 397 nm.

Det er heldigt, at de fleste producenter har standardiseret denne excitationsbølgelængde, da det giver bedre sammenligning. Det er dog helt gyldigt at flytte excitationsbølgelængden til en hvilken som helst anden værdi som en måde at teste følsomhed i et andet bølgelængdeområde (f.eks. NIR).

Emissionsscannningsområde: HORIBA-metoden scanner emissionsmonokromatoren fra 365 til 450 nm med intervaller på 0,5 nm for at samle hele Raman-spidsen ved 397 nm og også baggrunden ved 450 nm.

Båndbredde (slidsstørrelse): HORIBA-metoden bruger 5 nm båndpas spalter på både excitations- og emissionsspektrometre. Nogle producenter specificerer 10 nm slidser, som har den virkning at øge følsomheden sammenlignet med 5 nm. Det er blevet rapporteret, at en fordobling af den fysiske slidsstørrelse ved indgangen og udgangen af en monokromator kan firedoble intensiteten af excitation og emissionsdetekteringsgennemstrømningen, da gennemstrømningen går, når kvadratet for størrelsen stiger, men dette er et forenklet skøn, der skal måles. empirisk. HORIBA har målt faktorforskellen med HORIBA Fluoromax og observeret, at en fordobling af spalternes størrelse fra 5 til 10 nm for Fluoromax øger det samlede signal / støjforhold for Raman-båndet med en faktor på mere end 3 gange. Dette vil dog være forskelligt for alle fluorometre, så vær sikker på at sammenligne med identiske båndpas.

Integrationstid (eller responstid): Dette refererer til, hvor længe detektoren har lov til at indsamle et signal på en given trinposition for bølgelængde. Det spiller også en væsentlig rolle i den samlede følsomhed målt for et fluorometer. HORIBA-metoden bruger 1 sekunders integrationstid ved hvert bølgelængdepunkt, svarende til andre producenter. Imidlertid specificerer nogle producenter en responstid på 2 sekunder, hvilket øger det samlede signal / støjforhold med næsten en faktor på to. Sørg for at bruge den samme integrationstid (responstid), når du sammenligner.

PMT Type: De fleste spektrofluorometre bruger et fotomultiplikatorrør (PMT) som deres eneste detektor for fluorescensemission uden mulighed for at ændre detektorhuset. Dette gælder for de fleste analytiske fluorometre. Nogle af disse bench-top-systemer giver mulighed for valg af forskellige individuelle PMT’er med forskellige bølgelængdeområder og specifikationer. PMT’er, der ikke registrerer så langt ind i NIR som andre PMT’er, har et lavere mørktal, så de giver et bedre signal / støjforhold i området 350 til 400 nm, men de kan muligvis ikke bruges i hele emissionsbølgelængden det ønskede interval til et bestemt laboratorium. HORIBAs standard PMT, der anvendes i FluoroMax Plus-, Fluorolog3- og QuantaMaster 8000-serien af fluorometre, er Hamamatsu R928P PMT, der betragtes som industristandarden for fluorometer. I disse tilfælde skal du sørge for, at hvert fluorometer bruger den samme PMT, hvor det er muligt.

Optiske filtre: Et optisk filter kan føjes til den optiske sti til et fluorometer, enten på excitationssiden eller emissionssiden af prøven. Disse kan placeres manuelt i en filterholder inde i prøverummet, eller de kan være en del af et filterhjul, der automatisk kan placere forskellige filtre i den optiske sti, når forskellige eksperimentelle protokoller vælges. Optiske filtre har den virkning, at de afviser lyset ved givne bølgelængder, og de kan dramatisk forbedre signal / støjforholdet for et fluorometer. HORIBA bruger ikke andre optiske filtre end selve scanningsspektrometrene, når de specificerer SNR for vand Raman med specifikationerne Fluoromax, Fluorolog3 eller QuantaMaster 8000-serien.Når du sammenligner et HORIBA fluorometer med et fluorometer, der bruger automatiske filtre, skal du ikke bruge et filter, eller hvis det er automatisk, skal du bekræfte, hvilket filter og hvilken type filtre der anvendes, og hvor de anvendes, til at replikere en lignende eksperimentel metode med et HORIBA fluorometer.

Gælder for modulære forskningsfluorometre

Detektortype: Modulære forskningsfluorometre inkluderer typisk et PMT-hus som standard, men giver mulighed for forskellige typer enkeltkanaldetektorer for at udvide bølgelængden rækkevidde eller fluorescens levetid for et instrument. Alternative detektorer inkluderer afkølede PMT-huse, forskellige solid state-detektorer såsom InGaA’er, MCP PMT’er og så videre. Disse forskellige typer detektorer vil have dramatiske virkninger på signal / støjforholdet for en hvilken som helst bestemt prøvemåling, så her, når du prøver at sammenligne følsomheden af et fluorometer med et andet, skal du være sikker på at den samme detektortype bruges til at indsamle data på begge systemer.

Detektortemperatur: De fleste kommercielle spektrofluorometre bruger PMT-huse, der ikke er afkølet, og faktisk tilbyder mange instrumenter ikke engang en afkølet detektormulighed. Et afkølet PMT-hus kan forbedre følsomheden af et instrument ved at reducere mørketællingerne (baggrunden) sammenlignet med den samme nøjagtige PMT i et omgivende hus. HORIBAs standard PMT-huse i FluoroMaxPlus, Fluorolog3 og QuantaMaster 8000 er omgivende PMT-huse, men Fluorolog3- og QuantaMaster 8000-serierne tilbyder valgfrie afkølede PMT-huse for at forbedre følsomhed og NIR-detektion. Når du sammenligner modulære forskningsfluorometre, skal du sørge for at sammenligne data indsamlet med den samme type PMT-hus (omgivende eller afkølet), og hvis de afkøles, afkøles de også til den samme temperatur.

Single Versus Double Monochromator: Modular forskningsfluorometre tillader en forsker at vælge enkelt- eller dobbeltmonokromatorer på enten excitations- eller emissionsoptisk sti. Her henviser udtrykket dobbelt monokromator til to dispergerende ristetrin, den ene efter den anden, med en indgangsslids, mellemliggende slids og udgangsslids. En dobbelt monokromator kan konfigureres enten i additiv eller dispersiv tilstand, men i begge tilfælde er gennemstrømning og stray light-karakteristika for en enkelt versus en dobbelt monokromator meget forskellige og vil have stor indflydelse på SNR af en vand-Raman-scanning, selvom båndbredder, integrationstider og bølgelængder alle holdes konstante.

Ristetæthed af gitter: Rilletætheden af et gitter vil også påvirke gennemstrømningen og dermed følsomheden af et spektrofluorometer. For de fleste spektrofluorometre er dette ikke for meget af et problem, fordi systemerne kun er fremstillet med et bestemt gitter. I dette tilfælde er det vigtigste at sikre, at båndpaserne er valgt til at være de samme. Men for modulære fluorometre kan du konfigurere monokromatorer med forskellige gitre eller flere gitre. For disse systemer skal du være meget forsigtig med at holde tingene så ens som muligt. For eksempel når du har to instrumenter, der har lignende brændvidde-spektrometre, vil ændring af rilletætheden af gitteret øge eller mindske følsomheden for den samme 5 nm båndpasindstilling. HORIBA-metoden bruger gitre med en rilletæthed på 1.200 riller pr. Millimeter.

Rist af gitter: Risterne valgt til en excitations- eller emissionsmonokromator giver optimal gennemstrømning ved et bestemt bølgelængdebånd, kaldet flammen vinkel, da dette bestemmes af vinklen på gitteretsning, der tilføres på gitteroverfladen. Som sådan ville en excitationsmonochromator med en 350 nm flammet excitationsmonochromator og en 400 nm emissionsmonochromator være optimale valg for at opnå den bedste vandraman-følsomhed, når den blev spændende ved 350 nm. Da de fleste fluorometre ikke tillader dig at justere gitteret, er denne variabel ikke en faktor, men for dem, der giver dig mulighed for at vælge gitre, skal du sørge for at vælge gitre med den samme eller meget lignende, flammevinkel for at foretage en gyldig sammenligning .