Método experimental

Así como la fórmula utilizada para calcular la relación señal-ruido puede tener un efecto dramático en La sensibilidad aparente de cualquier conjunto de datos espectrales en particular, la configuración de hardware del instrumento y los parámetros experimentales de la adquisición de datos, también tienen un efecto dramático en la calidad del espectro adquirido.

Hay muchos parámetros de hardware, configuraciones y opciones que tienen un efecto en la sensibilidad medida de un espectrofluorómetro. Esto puede hacer que sea extremadamente difícil comparar absolutamente la sensibilidad relativa de dos instrumentos diferentes, si no se utilizan de una manera prácticamente idéntica. A continuación, analizamos cada uno de estos factores y el impacto que tienen en los datos resultantes.

Aplicable a todos los fluorómetros de barrido

Longitud de onda de excitación: La longitud de onda de excitación debe ser idéntica para todos los sistemas que se comparan. El método HORIBA utiliza una excitación de 350 nm para la banda de agua Raman, al igual que la mayoría de los otros fabricantes. Cuando se excita a 350 nm, la banda de emisión Raman para el agua tiene un pico a 397 nm.

Es una suerte que la mayoría de los fabricantes hayan estandarizado esta longitud de onda de excitación, ya que permite una mejor comparación. Sin embargo, es perfectamente válido mover la longitud de onda de excitación a cualquier otro valor como una forma de probar la sensibilidad en un rango de longitud de onda diferente (por ejemplo, el NIR).

Rango de escaneo de emisiones: el método HORIBA escanea el monocromador de emisión de 365 a 450 nm, con incrementos de 0,5 nm, para recolectar el pico Raman completo a 397 nm y también el fondo a 450 nm.

Ancho de banda (tamaño de rendija): el método HORIBA utiliza un paso de banda de 5 nm ranuras en los espectrómetros de excitación y emisión. Algunos fabricantes especifican ranuras de 10 nm que tienen el efecto de aumentar la sensibilidad en comparación con 5 nm. Se ha informado que duplicar el tamaño de la hendidura física en la entrada y salida de un monocromador puede cuadriplicar la intensidad de excitación y el rendimiento de detección de emisiones, ya que el rendimiento va a medida que aumenta el cuadrado del tamaño, pero esta es una estimación simplista que debe medirse empíricamente. HORIBA ha medido la diferencia de factores con HORIBA Fluoromax y ha observado que para Fluoromax, duplicar el tamaño de las rendijas de 5 a 10 nm aumenta la relación señal / ruido general para la banda Raman de agua en un factor de más de 3 veces. Sin embargo, esto será diferente para todos los fluorómetros, así que asegúrese de comparar con pasos de banda idénticos.

Tiempo de integración (o tiempo de respuesta): se refiere a cuánto tiempo se permite que el detector recopile una señal en un determinado posición del paso de longitud de onda. También juega un papel importante en la sensibilidad general medida por un fluorómetro. El método HORIBA utiliza un tiempo de integración de 1 segundo en cada punto de longitud de onda, similar a otros fabricantes. Sin embargo, algunos fabricantes especifican un tiempo de respuesta de 2 segundos que aumenta la relación señal / ruido general en casi un factor de dos. Asegúrese de utilizar el mismo tiempo de integración (respuesta) al comparar.

Tipo de PMT: la mayoría de los espectrofluorómetros utilizan un tubo fotomultiplicador (PMT) como único detector de emisión de fluorescencia, sin ninguna opción para cambiar la carcasa del detector. Esto es cierto para la mayoría de los fluorómetros analíticos de sobremesa. Algunos de estos sistemas de sobremesa permiten la selección de diferentes PMT individuales con diferentes rangos de longitud de onda y especificaciones. Los PMT que no detectan tan lejos en el NIR como otros PMT tendrán un recuento de oscuridad más bajo, por lo que proporcionarán una mejor relación señal / ruido en el rango de 350 a 400 nm; sin embargo, es posible que no se puedan utilizar en toda la longitud de onda de emisión. rango deseado para un laboratorio en particular. El PMT estándar de HORIBA que se utiliza en las series de fluorómetros FluoroMax Plus, Fluorolog3 y QuantaMaster 8000 es el PMT Hamamatsu R928P, que se considera el estándar de la industria para la fluorometría. En estos casos, asegúrese de que cada fluorómetro esté usando el mismo PMT, siempre que sea posible.

Filtros ópticos: se puede agregar un filtro óptico a la ruta óptica de un fluorómetro, ya sea en el lado de excitación o en el lado de emisión de la muestra. Estos pueden colocarse manualmente en un portafiltros dentro del compartimento de la muestra, o pueden ser parte de una rueda de filtros que puede colocar automáticamente diferentes filtros en la ruta óptica cuando se seleccionan diferentes protocolos experimentales. Los filtros ópticos tienen el efecto de mejorar el rechazo de la luz parásita en longitudes de onda dadas y pueden mejorar drásticamente la relación señal / ruido de un fluorómetro. HORIBA no utiliza ningún filtro óptico, aparte de los propios espectrómetros de barrido, al especificar la SNR para el agua Raman con las especificaciones de las series Fluoromax, Fluorolog3 o QuantaMaster 8000.Al comparar un fluorómetro HORIBA con un fluorómetro que utiliza filtros automáticos, no utilice un filtro o, si es automático, confirme qué marca y tipo de filtros se utilizan, y dónde se emplean, para replicar un método experimental similar con un fluorómetro HORIBA.

Aplicable a fluorómetros de investigación modulares

Tipo de detector: Los fluorómetros de investigación modulares generalmente incluyen una carcasa PMT como estándar, pero permiten muchos tipos diferentes de detectores de un solo canal para extender la longitud de onda rango, o rango de vida útil de fluorescencia de un instrumento. Los detectores alternativos incluyen carcasas PMT refrigeradas, varios detectores de estado sólido como InGaAs, MCP PMT, etc. Estos diferentes tipos de detectores tendrán efectos dramáticos en la relación señal / ruido de cualquier medición de muestra en particular, así que aquí nuevamente, cuando intente comparar la sensibilidad de un fluorómetro con otro, asegúrese de que se use el mismo tipo de detector para recolectar datos sobre ambos sistemas.

Temperatura del detector: la mayoría de los espectrofluorómetros comerciales utilizan carcasas PMT que no están refrigeradas y, de hecho, muchos instrumentos ni siquiera ofrecen una opción de detector refrigerado. Una carcasa PMT enfriada puede mejorar la sensibilidad de un instrumento al reducir los recuentos oscuros (fondo) en comparación con la misma PMT exacta en una carcasa ambiental. Las carcasas PMT estándar de HORIBA en FluoroMaxPlus, Fluorolog3 y QuantaMaster 8000 son carcasas PMT ambientales, sin embargo, las series Fluorolog3 y QuantaMaster 8000 ofrecen carcasas PMT refrigeradas opcionales para mejorar la sensibilidad y la detección NIR. Al comparar fluorómetros de investigación modulares, asegúrese de comparar los datos recopilados con el mismo tipo de carcasa PMT (ambiente o refrigerada) y, si se enfría, también se enfría a la misma temperatura.

Monocromador simple versus doble: modular Los fluorómetros de investigación permiten a un investigador seleccionar monocromadores simples o dobles en la ruta óptica de excitación o emisión. Aquí el término doble monocromador se refiere a dos etapas de rejilla dispersiva, una tras otra, con una rendija de entrada, una rendija intermedia y una rendija de salida. Un monocromador doble se puede configurar en el modo aditivo o dispersivo, pero en cualquier caso, el rendimiento y las características de luz parásita de un monocromador simple frente a uno doble son muy diferentes y tendrán un gran impacto en el SNR de un escaneo Raman de agua. incluso si los anchos de banda, los tiempos de integración y las longitudes de onda se mantienen constantes.

Densidad de ranura de la rejilla: La densidad de ranura de una rejilla también afectará el rendimiento y, por lo tanto, la sensibilidad de un espectrofluorómetro. Para la mayoría de los espectrofluorómetros, esto no es un gran problema porque los sistemas se fabrican con una sola rejilla en particular. En este caso, lo más importante es asegurarse de que los pases de banda se seleccionen para que sean los mismos. Sin embargo, para los fluorómetros modulares, puede configurar los monocromadores con diferentes rejillas o múltiples rejillas. Para estos sistemas, debe tener mucho cuidado de mantener las cosas lo más similares posible. Por ejemplo, cuando tiene dos instrumentos que tienen espectrómetros de distancia focal similar, cambiar la densidad de surco de la rejilla aumentará o disminuirá la sensibilidad para la misma configuración de paso de banda de 5 nm. El método HORIBA utiliza rejillas con una densidad de arboleda de 1.200 ranuras por milímetro.

Ángulo de rejilla de llamarada: las rejillas seleccionadas para un monocromador de excitación o emisión proporcionan un rendimiento óptimo en una banda de longitud de onda particular, conocida como llamarada ángulo ya que está determinado por el ángulo de grabado de la rejilla impartido sobre la superficie de la rejilla. Como tal, un monocromador de excitación con un monocromador de excitación flameado de 350 nm y un monocromador de emisión de 400 nm serían opciones óptimas para lograr la mejor sensibilidad Raman del agua cuando se excita a 350 nm. Dado que la mayoría de los fluorómetros no le permiten ajustar la rejilla, esta variable no es un factor, pero para aquellos que sí le permiten elegir rejillas, asegúrese de elegir rejillas con el mismo ángulo de llama o muy similar para hacer una comparación válida. .