Introducción

La transferencia horizontal de genes (HGT) entre células bacterianas contribuye a la adaptación bacteriana a diversos entornos y, a largo plazo, a la evolución bacteriana (Lorenz y Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas y Nielsen, 2005). Sin embargo, en ambientes humanos, causa una propagación indeseable de patogenicidad, resistencia a antibióticos o genes diseñados artificialmente (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Generalmente se aceptan tres mecanismos de HGT en bacterias: conjugación, transducción y transformación (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). La conjugación y la transducción implican un aparato específico para la transferencia de ADN de las células del donante a las receptoras; estos son viriones conjugativos de pili y fagos, respectivamente. La transformación es principalmente una función de las células receptoras que expresan competencia para absorber ADN desnudo extracelular.

La competencia de transformación puede ser inducida natural o artificialmente, pero no todas las especies bacterianas desarrollan competencia natural (Lorenz y Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). En las bacterias naturalmente transformables, la competencia suele ser transitoria e inducida por alteraciones en el estado de crecimiento del organismo (Johnston et al., 2014). Se ha identificado un grupo de «genes de competencia» y se han propuesto modelos mecanicistas generales (Chen y Dubnau, 2004), aunque no se han dilucidado suficientemente los mecanismos precisos para las especies bacterianas individuales (Cameron y Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz y Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska y Gerdes, 2015). Debido a que la transformación requiere ADN desnudo extracelular como sustrato, la sensibilidad a la ADNasa, que degrada el ADN desnudo, es clave para distinguir la transformación de otras Mecanismos HGT resistentes a ADNasa (Lorenz y Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa y Berenguer, 2015).

En general, No se cree que la Escherichia coli sea transformable de forma natural; desarrolla una alta competencia genética solo en condiciones artificiales, incluida la exposición a altas concentraciones de Ca2 + y el choque térmico (Mandel y Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polietilenglicol tratar ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989) o descargas eléctricas (Sambrook y Russell, 2006). Sin embargo, según se informa, E. coli puede expresar una competencia modesta bajo ciertas condiciones que son factibles en sus ambientes naturales (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . A continuación, definimos la transformación en la que el plásmido se agregó externamente como transformación de plásmido (PT) y la transformación en la que el ADN plasmídico proviene de células bacterianas muertas (del medio ambiente) como transferencia de plásmido horizontal por transformación (HPTT).

Escherichia coli parece poseer múltiples mecanismos de absorción de ADN, incluidos dos populares: uno que depende de los «genes de competencia», que comúnmente funcionan en muchas bacterias gramnegativas y positivas (Finkel y Kolter, 2001; Palchevskiy y Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha y Redfield, 2012; Seitz y Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska y Gerdes, 2015). Este mecanismo es conducido principalmente por el aparato molecular específico formado alrededor de la superficie celular. estructura, que atraviesa las membranas celulares solo ADN monocatenario lineal producido mediante una nucleasa periplásmica específica. En E. coli, no se considera que estos genes contribuyan a PT porque PT requiere la captación de doble s intactos ADN circular transcrito (Sinha y Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Por tanto, es poco probable que este mecanismo contribuya al TP en el medio ambiente. El segundo mecanismo es el que depende de factores ambientales externos, como iones metálicos divalentes, choque térmico y estrés físico (Mandel y Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Se considera comúnmente que estos estímulos inducen la formación de estructuras similares a poros en la superficie celular para el paso de ADN de doble hebra intacto, incluidos plásmidos circulares, aunque los detalles siguen sin estar claros (Reusch et al., 1986; Reusch y Sadoff, 1988; Huang y Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Los iones Ca2 + y Mg2 + son los factores inductores de competencia más típicos. Los hábitats ambientales a menudo contienen varios milimolares de estos iones, cuyas concentraciones son suficientes para inducir una competencia débil pero detectable en E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Por tanto, este mecanismo es posible en el entorno fuera de los laboratorios. Además de los dos mecanismos anteriores, Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) y Sun (2016), en los que intervienen un transportador ABC y proteínas periplásmicas específicas y de la membrana interna. Este mecanismo está regulado por reguladores transcripcionales internos, RpoS y CRP, por lo que se sugirió que este mecanismo también es un proceso natural controlado genéticamente.

En esta mini revisión, resumimos nuestros estudios sobre HGT usando E. coli sistemas experimentales y discutir la posible ocurrencia de transformación por múltiples mecanismos en ambientes naturales y su posible impacto en la propagación de genes de resistencia a antibióticos.

Transformación de plásmido de E. coli en condiciones que imitan el ambiente natural

PT en extractos de alimentos

Los alimentos humanos son excelentes medios de cultivo para muchas bacterias. Sin embargo, se ha prestado poca atención a los efectos de los alimentos sobre la fisiología bacteriana distintos del crecimiento y la supervivencia. Investigamos la posibilidad de que los alimentos actúen como medio para la transformación bacteriana. Los alimentos a menudo contienen concentraciones milimolares de iones metálicos divalentes (Ca2 + y Mg2 +) y a menudo se almacenan en un refrigerador o congelador seguido de un calentamiento rápido (es decir, golpe de calor). Estas condiciones conducen al desarrollo de competencias en E. coli (Mandel y Higa, 1970; Huang y Reusch, 1995; Baur et al., 1996); debido a que E. coli es un contaminante común de los alimentos, es interesante determinar si se puede transformar en alimentos. De hecho, ciertos alimentos pueden actuar como medios que inducen la competencia en E. coli (Maeda et al., 2003). De 42 muestras de alimentos analizadas, > 10 mostraron la capacidad de inducir competencia en una frecuencia de 10−7−10−9. Entre estos, el sobrenadante de tofu (un alimento similar al queso hecho de leche de soja cuajada) exhibió la actividad más alta (una en 10-7-10-8 células receptoras), lo que corresponde aproximadamente a la mitad de la eficiencia obtenida con 100 mM CaCl2. Sin embargo, no hubo correlaciones claras entre las frecuencias de transformación y las características químicas de los alimentos (concentraciones de Ca2 + o Mg2 + y pH), lo que sugiere que factores complejos dentro de los alimentos afectan el desarrollo de la competencia. Se han informado efectos similares de los alimentos para inducir la transformación en E. coli (Bauer et al., 1999) y Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT in Biopelícula de aire sólido

Muchas bacterias existen como biopelículas en entornos naturales y artificiales (Davey y O’Toole, 2000). Las biopelículas son agregados de microbios que se forman en las interfaces sólido-líquido o sólido-aire (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Las células de estos cultivos de alta densidad interactúan entre sí y expresan funciones fisiológicas distintivas en comparación con sus formas planctónicas libres. Los estudios anteriores sobre la transformación de E. coli se centraron exclusivamente en las células planctónicas (Mandel y Higa, 1970; Hanahan, 1983), pero mostramos que las células de E. coli dentro de las biopelículas de SA desarrollan competencia a una frecuencia de 10−6−10−8 en varios medios sólidos, incluido el agar LB y H2O y varios alimentos húmedos (Maeda et al., 2004). Las células vivas generalmente coexisten con las células muertas en las biopelículas, y estas últimas pueden liberar su ADN y ciertos iones metálicos divalentes, incluidos Ca2 + y Mn2 +, en el microambiente local de la biopelícula (Davey y O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002). ). Estas condiciones pueden favorecer el desarrollo de la transformación y pueden no ser exclusivas de las biopelículas de SA, ya que también se ha informado de una mejora similar en las biopelículas de aire-líquido de E. coli (Król et al., 2011).

PT de cepas de E. coli silvestres en agua

Nuestros resultados y los de otros sugieren que la E. coli ambiental puede potencialmente adquirir ADN extraño a través de la transformación. Sin embargo, existen pocos informes previos de investigaciones sobre la transformabilidad de cepas naturales de E. coli (Woegerbauer et al., 2002; Sinha y Redfield, 2012). Por lo tanto, examinamos el potencial de las cepas naturales de E. coli para desarrollar competencia en condiciones ambientales. Usamos una colección estándar de E. coli de cepas de referencia (ECOR) como nuestro modelo de E. coli natural (Ochman y Selander, 1984) porque estas cepas ECOR se han utilizado ampliamente en varios estudios sobre la fisiología, el comportamiento y la variación genotípica de E. coli natural (Tenaillon et al., 2010). Encontramos que algunas cepas ECOR exhibieron transformabilidad detectable (10-10-10-11) en agua natural (agua pura natural embotellada comercialmente disponible) a temperaturas constantes y variables entre 5 y 35 ° C y a temperaturas invernales en un experimento de campo, lo que sugiere que E. coli natural puede potencialmente desarrollar competencia bajo ciertas condiciones que podrían ocurrir en el medio ambiente (Matsumoto et al., 2016b).

Transferencia horizontal de plásmidos por transformación en E. coli

HPTT inducido por congelación-descongelación en aguas naturales y extractos de alimentos

En el medio ambiente, las células muertas pueden suministrar ADN desnudo de forma natural a las células vecinas dentro del mismo hábitat o microambiente.Por lo tanto, vale la pena investigar la posibilidad de HPTT en un sistema cerrado bajo algunas condiciones factibles. La congelación-descongelación es un proceso común en la manipulación de alimentos y también ocurre en la naturaleza. El tratamiento por congelación-descongelación de las células de E. coli puede promover la fuga de ADN de las células muertas y la subsiguiente absorción por las células supervivientes porque responden al choque térmico, lo que resulta en una transformación in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Este tratamiento de suspensiones condensadas de cepas mixtas de E. coli en aguas naturales y extractos de alimentos provocó la transferencia lateral in situ de plásmidos no conjugativos con una frecuencia de 10−8−10−10 (Ishimoto et al., 2008). Este fenómeno también ocurrió incluso después de 1 a 2 meses de almacenamiento a -20 ° C, y su sensibilidad a la DNasa demostró que estaba mediada por un mecanismo de transformación.

Baja frecuencia de HPTT en biopelículas de SA

Se cree que las biopelículas son entornos adecuados para la transformación in situ porque las células vivas y muertas coexisten muy cerca, y el ADN liberado de las células muertas a menudo se acumula alrededor de las células vivas. Además, como se describió anteriormente, debido a que las células de E. coli pueden desarrollar una competencia modesta en las biopelículas de SA (Maeda et al., 2004), ambos factores contribuyen al HPTT en las biopelículas. Simplemente cocultivando una cepa libre de plásmidos con una que alberga un plásmido no conjugativo en una biopelícula de SA en medio de agar sin antibióticos, las células transformadas se produjeron a baja frecuencia (10-9-10-10) en 24-48 h (Maeda et al., 2006). Los cultivos líquidos de las mismas cepas en caldo LB produjeron pocos o ningún transformante, lo que sugiere la importancia de la formación de biopelículas SA para la transferencia de plásmidos. Esencialmente, el mismo fenómeno ocurrió en biopelículas de SA en medios basados en alimentos (Ando et al., 2009). Este fenómeno también ocurrió entre cepas de laboratorio populares como DH5, HB101 y MG1655 (Etchuuya et al., 2011), que no contienen fagos lisogénicos ni aparatos conjugativos, lo que sugiere que la baja frecuencia de transferencia horizontal de plásmidos en biopelículas de SA puede ocurren sin la ayuda de fagos o maquinaria de conjugación y, por tanto, que esta transferencia de ADN se debe a una especie de transformación. Sin embargo, dado que la mutación rpoS− no afectó a este HPTT (Maeda et al., 2006), es poco probable que el mecanismo dependiente de RpoS (Zhang et al., 2012) esté involucrado.

Alta frecuencia de HPTT Inducida por el fago P1

Al evaluar combinaciones de varias cepas y plásmidos para la transferencia horizontal de plásmidos, se descubrió que la cepa de E. coli CAG18439 actúa como donante y receptor de plásmido en combinación con el plásmido pHSG299 y con frecuencia podría transferir el plásmido en un cultivo celular mixto incluso en un medio líquido (Etchuuya et al., 2011). Se demostró que esta HGT era un tipo de transformación porque la transferencia de plásmido de alta frecuencia (10−5−10−8) era sensible a la ADNasa. Otros estudios revelaron que este fenómeno exhibe algunas características específicas: (1) promoción por el factor proteico liberado de CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) promoción mediante una secuencia de 88 pb en pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) alta frecuencia de transferencia (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); y (4) dependencia de genes específicos (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Con respecto a (1), un estudio posterior reveló que estos factores proteicos incluyen una partícula de fago P1vir (o un derivado de la misma) y que el fago P1vir agregado externamente puede reproducir la transferencia de plásmido horizontal entre las células de E. coli y las otras tres características principales de CAG18439 HPTT dependiente (Sugiura et al., 2017). Este fenómeno también fue en gran parte sensible a la ADNasa, lo que sugiere que una gran parte de esta transferencia de plásmido se debe a la transformación a pesar de la participación del fago P1. El mecanismo de transformación de la transferencia de plásmido inducida por fagos P1vir puede deberse a una infección por fagos o al despertar espontáneo del fago lisogenizado en células que albergan plásmidos, lo que lleva a la lisis celular y la posterior liberación de ADN plasmídico intracelular en una forma utilizable para la transformación. Aunque tal mecanismo es generalmente factible, ha habido pocas demostraciones claras de él en E. coli. Un estudio reciente de Keen et al. (2017) utilizando otro sistema de fagos también demostró un mecanismo de transformación inducido por fagos similar en E. coli. Sin embargo, el HPTT por P1vir o CAG18439 no puede explicarse adecuadamente solo por el aumento del suministro de ADN de la lisis celular inducida por fagos y difiere de la transformación simple en E. coli (Hanahan, 1983) en términos de sus características distintivas (2-4). Con respecto a (2), la secuencia de 88 pb en pHSG299 no es homóloga a la parte de la secuencia del genoma del fago P1. Esta secuencia se encuentra a menudo en bases de datos entre secuencias de vectores de clonación generales, pero no en ninguna fuente natural. Sin embargo, al rastrear el proceso de construcción de pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), sospechamos que la secuencia de 88 bp se origina en R6-5, un plásmido R conjugativo.Esta secuencia, y elementos de ADN similares, pueden contribuir al HPTT de R y otros plásmidos en el medio ambiente. Con respecto a (3), esta transferencia de alta frecuencia no puede explicarse por la capacidad de TP simple de CAG18439 y otras cepas utilizadas porque el TP simple en esas cepas bajo la condición de cultivo equivalente fue 105-102 veces menos frecuente (Etchuuya et al., 2011). Por lo tanto, se sugirió que un factor proteináceo derivado de CAG18439, con un tamaño estimado entre 9 y 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) también podría estar involucrado en la promoción de HPTT. Este factor presumiblemente ayuda a la absorción de ADN por las células receptoras, probablemente en combinación con la secuencia de 88 pb en el ADN transformante. Por último, con respecto a (4), estudios posteriores de cribado de todo el genoma para genes receptores implicados en HPTT sugirieron que múltiples genes participan en el mecanismo (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Estos incluyen aquellos que no se ha informado que estén involucrados en la transformación natural o artificial en E. coli (como rodZ) y algunos homólogos de genes de competencia conocidos, como ybaV e yhiR (Finkel y Kolter, 2001; Palchevskiy y Finkel, 2006 ), pero no incluyen rpoS y otros genes relacionados con el mecanismo dependiente de RpoS (Zhang et al., 2012). En general, estos resultados apuntan hacia un mecanismo complejo desconocido de HPTT de alta frecuencia inducido por fagos que puede compartir en parte la vía de transformación natural.

HPTT entre cepas naturales de E. coli

Para evaluar más la generalidad y variedad de HPTT en cepas de E. coli, se utilizaron cepas naturales (las cepas ECOR antes mencionadas) en un estudio de HPTT. Se cultivaron conjuntamente varias combinaciones de cepas ECOR en medios líquidos, lo que resultó en una transferencia horizontal sensible a la ADNasa de genes de resistencia a antibióticos naturales (Matsumoto et al., 2016a, b). El aislamiento de plásmidos de estos nuevos transformantes demostró la transferencia horizontal de plásmidos entre cepas ECOR (Matsumoto et al., 2016a, b). Los experimentos de PT simples que utilizan las mismas cepas ECOR revelaron que HPTT ocurre con mucha más frecuencia (10−6−10−8) que PT simple (por debajo de 10−10) en las mismas condiciones de cultivo, lo que sugiere que HPTT es único y efectivo. Además, descubrimos que 6 de 12 combinaciones de las cepas ECOR, algunas de las cuales no producen fagos formadores de placa (Shibata et al., 2014b), exhibían transferencia de genes sensibles a la ADNasa, lo que nos lleva a sospechar que el HPTT es bastante común en los Cepas de E. coli. En general, estos datos sugieren que algunos mecanismos de transformación libres de fagos y conjugación también existen naturalmente en algunas cepas de E. coli y que HPTT de plásmidos naturales resistentes a antibióticos (como plásmidos de la cepa ECOR24: números de acceso AB905284 y AB905285) puede ser una vía para producir células de E. coli naturales resistentes a múltiples fármacos.

Posibles mecanismos y viabilidad de PT y HPTT en E. coli en el medio ambiente

Ejemplos de PT y Los HPTT inducidos por congelación-descongelación y de baja frecuencia presentados en esta mini revisión probablemente estén más relacionados con el mecanismo de formación de poros que con el mecanismo dependiente del gen de competencia porque los alimentos y las aguas naturales a menudo contienen niveles mM de iones Ca2 + y Mg2 + (Baur et al. al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), y el entorno de biopelícula suministra a las células vivas el contenido de células muertas, incluidos iones metálicos divalentes y ADN plasmídico transformable. Como describimos anteriormente (Maeda et al., 2006), una biopelícula de SA (diámetro, 10-12 mm; grosor, 0.5-0.8 mm) contiene aproximadamente 2-5 × 109 células. Además, las bacterias intestinales en los mamíferos generalmente ascienden a aproximadamente 1011 células / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Teniendo en cuenta la enorme escala del medio ambiente, incluso las frecuencias de transformación de 10−9−10−10 no pueden subestimarse, ya que tendrán un impacto en las poblaciones de bacterias.

El HPTT de alta frecuencia descrito en este artículo puede involucrar no solo el mecanismo de formación de poros, sino también una parte de las funciones del gen de competencia y posiblemente otro mecanismo desconocido, como se mencionó anteriormente. Debido a que los bacteriófagos son uno de los organismos más abundantes en la biosfera y omnipresentes en el medio ambiente (Clokie et al., 2011), el HPTT inducido por fagos también se considera factible en el medio ambiente, así como la transducción ordinaria y otros derivados de fagos. formas de HGT, por ejemplo, agentes de transferencia de genes (Lang et al., 2012).

Conclusión y perspectiva

En general, nuestros resultados y los datos previos relacionados indican que múltiples mecanismos inducen transformación tipo HGT en E. coli según diversas circunstancias ambientales y celulares, como la naturaleza de los medios (por ejemplo, agua y alimentos), temperatura variable de bajo cero a ∼40 ° C, alta densidad celular en biopelículas y antecedentes genéticos variables de las cepas implicadas. La contribución de la HGT de tipo transformación a la dinámica genética en el medio ambiente puede estar subestimada (Bushman, 2002; Thomas y Nielsen, 2005), y nuestros estudios indican que la HPTT en E.coli ocurre a frecuencias de transferencia sustanciales (10−5−10−10) en las condiciones que se pueden encontrar en el medio ambiente. Por lo tanto, la HGT de tipo transformación puede contribuir a la propagación de genes de resistencia a los antibióticos y a la aparición de bacterias multirresistentes en el entorno real fuera de los laboratorios. Se necesitan más estudios para comprender el papel preciso y la contribución de la HGT de tipo transformación en la propagación de la resistencia a los antibióticos.

Contribuciones de los autores

HH, ES y SM escribieron el artículo.

Financiamiento

Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación fue realizado en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Enago (www.enago.jp) para inglés servicios de edición y corrección de pruebas.