Toulouse-Lautrec decidió ser pintor, y con el apoyo de su tío Charles y varios pintores amigos de la familia, como Princeteau, John Lewis Brown y Jean-Louis Forain, fue a vivir a París en 1881. Allí, fue alumno de Léon Bonnat, que era un retratista de moda, y, cuando se cerró el taller de Bonnat en septiembre de 1882, tuvo que buscar un nuevo maestro, que fue Fernand Cormon. En el estudio de Cormon se hizo amigo de Vincent van Gogh.

En 1884 Toulouse-Lautrec fue a vivir al barrio de Montmartre, donde tuvo vecinos como Edgar Degas. La fascinación que sentía por los locales de diversión nocturnos le llevó a frecuentarlos con asiduidad y hacerse cliente habitual de algunos de ellos, como el Salón de la Rue des Moulins, el Moulin de la Galette, el Moulin Rouge, Le Chat Noir o el Folies Bergère. Todo lo relacionado con este mundo, incluida la prostitución, constituyó uno de los temas principales en su obra. En sus obras de los bajos fondos de París pintaba a los actores, bailarines, burgueses y prostitutas. A estas las pintaba en su vida cotidiana: mientras se cambiaban, cuando acababan cada servicio o cuando esperaban una inspección médica.

Al contrario que los artistas impresionistas, apenas se interesó por el género del paisaje, y prefirió ambientes cerrados, iluminados con luz artificial, que le permitían jugar con los colores y encuadres de forma subjetiva. Muy observador, le atraían la gestualidad de los cantantes y comediantes, y le gustaba ridiculizar la hipocresía de los poderosos, que rechazaban en voz alta los mismos vicios y ambientes que degustaban en privado.

Los dueños de los cabarets le pedían que dibujara carteles para promocionar sus espectáculos, algo que entusiasmó mucho a Lautrec, ya que en sus largas noches en estos locales dibujaba todo lo que veía y lo dejaba por las mesas. Al contrario que el incomprendido Vincent van Gogh, Toulouse-Lautrec llegó a vender obras y fue reconocido, si bien su popularidad radicó en sus ilustraciones para revistas y carteles publicitarios más que en la pintura al óleo.

Tuvo grandes amigas como la bailarina Jane Avril, a la cual dedicó varios cuadros y carteles. Conoció a bailarines reconocidos como Valentín el Descoyuntado, payasos y demás personajes de las fiestas y espectáculos de los suburbios. Este mundillo de vicio y extravagancia fue un refugio para Lautrec, quien se sentía rechazado por la nobleza a la que pertenecía por origen. Su discapacidad causaba rechazo en los salones chic, y en Montmartre pudo pasar desapercibido y dar rienda suelta a su bohemia. Criticaba a todos aquellos que reflejaban paisajes en sus cuadros, ya que él opinaba que lo que verdaderamente valía la pena eran las personas, el pueblo. Se consideraba a sí mismo un cronista social y se mezcló, pintó y fue como el pueblo. Pintó grandes obras como La inspección médica.

En 1886 abandonó el estudio de Cormon y arrendó el suyo propio. En los años 1890 viajó hasta Londres, donde conoció y retrató a Oscar Wilde; también diseñó el programa de mano (folleto o cuadernillo) repartido en el estreno parisino de su drama Salomé.

Tenía problemas con el alcohol y además contrajo sífilis, lo que muchas veces derivaba en accesos de locura. El alcoholismo deterioró su salud, y a partir de 1897 padeció manías, depresiones y neurosis, además de ataques de parálisis en las piernas y en un costado. En 1897 tuvo que ser recogido de las calles a causa de una borrachera, y poco después en un delírium trémens llegó a disparar a las paredes de su casa creyendo que estaban llenas de arañas. Sin embargo, seguía pintando de forma firme y rápida; pero lo volvieron a recoger alcoholizado en 1899 y lo internaron en un sanatorio mental, donde realizó una colección de pinturas sobre el circo. Le dejaron ir a casa de su madre en las posesiones de ésta cerca de Burdeos, y el 9 de septiembre de 1901 murió postrado en su cama.

En 1922 su madre y su marchante abrieron el Museo Toulouse-Lautrec en el Palacio de la Berbie, Albi, muy visitado y reconocido por su amplia colección.