kokeellinen menetelmä

Aivan kuten signaalin ja kohinasuhteen laskemiseen käytetyllä kaavalla voi olla dramaattinen vaikutus minkä tahansa tietyn spektrijoukon näennäinen herkkyys, instrumentin laitteistokokoonpano ja tiedonkeruun kokeelliset parametrit vaikuttavat myös dramaattisesti hankitun spektrin laatuun.

Laitteistoparametreja on monia, asetukset ja vaihtoehdot, jotka kaikki vaikuttavat spektrofluorometrin mitattuun herkkyyteen. Tämä voi tehdä äärimmäisen vaikeaksi vertailla ehdottomasti kahden eri instrumentin suhteellista herkkyyttä, ellei niitä käytetä käytännössä samalla tavalla. Seuraavassa käsitellään näitä tekijöitä ja niiden vaikutusta saatuihin tietoihin.

Koskee kaikkia pyyhkäiseviä fluorimittareita

Viritysaallonpituuden: Viritys-aallonpituuden tulee olla sama kaikissa vertailtavissa järjestelmissä. HORIBA-menetelmä käyttää 350 nm: n viritystä Raman-vesialueelle, samoin kuin useimmat muut valmistajat. Kun jännitys on 350 nm: ssä, veden Raman-päästökaistan huippu on 397 nm.

On onnekasta, että useimmat valmistajat ovat standardoineet tämän viritysaallonpituuden, koska se mahdollistaa paremman vertailun. On kuitenkin pätevä siirtää heräteaallonpituus mihin tahansa muuhun arvoon, jotta voidaan testata herkkyys eri aallonpituusalueella (esim. NIR).

Päästöskannausalue: HORIBA-menetelmä skannaa emissiomonokromaattoria 365-450 nm, 0,5 nm: n välein, jotta koko Raman-huippu kerätään 397 nm: ssä ja myös tausta 450 nm: ssä.

Kaistanleveys (raon koko): HORIBA-menetelmä käyttää 5 nm: n kaistanpäästöä rakot sekä viritys- että emissiospektrometrit. Jotkut valmistajat määrittelevät 10 nm: n rakot, mikä lisää herkkyyttä verrattuna 5 nm: iin. On raportoitu, että fyysisen raon koon kaksinkertaistaminen monokromaattorin sisään- ja uloskäynnillä voi nelinkertaistaa virityksen voimakkuuden ja päästöjen havaitsemisen läpimenon, koska läpäisykyky kulkee koon neliön kasvaessa, mutta tämä on yksinkertainen arvio, joka tulisi mitata empiirisesti. HORIBA on mitannut tekijäeron HORIBA Fluoromax -laitteeseen nähden ja havainnut, että Fluoromaxille rakojen koon kaksinkertaistaminen 5: stä 10 nm: iin lisää veden Raman-vyöhykkeen kokonaissignaali-kohinasuhdetta yli 3 kertaa. Tämä on kuitenkin erilainen kaikilla fluorometreillä, joten muista verrata identtisiin kaistanleveyksiin.

Integraatioaika (tai vasteaika): Tämä viittaa siihen, kuinka kauan ilmaisimen saa kerätä signaalia tietyllä hetkellä aallonpituuden askelasento. Sillä on myös merkittävä rooli fluorometrille mitatussa kokonaisherkkyydessä. HORIBA-menetelmä käyttää yhden sekunnin integraatioaikaa kussakin aallonpistepisteessä, samalla tavalla kuin muut valmistajat. Jotkut valmistajat määrittelevät kuitenkin 2 sekunnin vasteajan, joka lisää signaalin ja kohinan suhdetta melkein kaksinkertaiseksi. Varmista, että käytät samaa integrointi- (vasteaika) -aikaa verrattaessa.

PMT-tyyppi: Useimmat spektrofluorometrit käyttävät ainoaa fluoresenssipitoisuuden ilmaisimena valokerroinputkea (PMT) ilman mahdollisuutta muuttaa tunnistimen koteloa. Tämä pätee useimpiin analyyttisiin fluorimittareihin. Jotkut näistä penkkijärjestelmistä mahdollistavat eri yksittäisten PMT-laitteiden valinnan, joilla on erilaiset aallonpituusalueet ja tekniset eritelmät. PMT: llä, joka ei havaitse niin kaukana NIR: stä kuin muilla PMT: llä, on matalampi tumma määrä, joten ne tarjoavat paremman signaali-kohinasuhteen 350-400 nm: n alueella, mutta ne eivät välttämättä ole käyttökelpoisia koko emissioaallonpituudella haluttu alue tietylle laboratorialle. HORIBAn tavallinen PMT, jota käytetään FluoroMax Plus-, Fluorolog3- ja QuantaMaster 8000 -sarjan fluorometreissä, on Hamamatsu R928P PMT, jota pidetään fluorometrian alan standardina. Tällöin varmista, että jokainen fluorometri käyttää samaa PMT: tä, mikäli mahdollista.

Optiset suodattimet: Optinen suodatin voidaan lisätä fluorometrin optiseen polkuun joko viritys- tai emissiopuolella. näytteestä. Ne voidaan sijoittaa manuaalisesti näytetilan sisällä olevaan suodattimen pidikkeeseen tai ne voivat olla osa suodatinpyörää, joka voi automaattisesti sijoittaa eri suodattimet optiseen polkuun, kun eri kokeelliset protokollat valitaan. Optisten suodattimien vaikutus parantaa hajavalon hylkäämistä tietyillä aallonpituuksilla, ja ne voivat dramaattisesti parantaa fluorometrin signaali-kohinasuhdetta. HORIBA ei käytä muita optisia suodattimia kuin itse pyyhkäisyspektrometrejä määrittäessään SNR-arvoa Raman-vedelle Fluoromax-, Fluorolog3- tai QuantaMaster 8000 -sarjan spesifikaatioilla.Vertaamalla HORIBA-fluorometriä automaattisia suodattimia käyttävään fluorometriin, älä käytä suodatinta, tai jos se on automaattinen, vahvista, minkä tyyppisiä suodattimia käytetään ja missä niitä käytetään, toistaaksesi samanlainen kokeellinen menetelmä HORIBA-fluorometri.

Sovellettavissa modulaarisiin tutkimusfluorometreihin

Detektorityyppi: Modulaariset tutkimusfluorometrit sisältävät tyypillisesti PMT-kotelon vakiona, mutta mahdollistavat monenlaisten yksikanavaisen ilmaisimen aallonpituuden pidentämisen. välineen tai fluoresenssin käyttöiän alue. Vaihtoehtoisiin ilmaisimiin kuuluvat jäähdytetyt PMT-kotelot, erilaiset kiinteän tilan ilmaisimet, kuten InGaAs, MCP PMT ja niin edelleen. Nämä erityyppiset ilmaisimet vaikuttavat dramaattisesti minkä tahansa näytemittauksen signaali-kohinasuhteeseen, joten kun taas yrität verrata yhden fluorometrin herkkyyttä toiseen, varmista, että samaa detektorityyppiä käytetään tietojen keräämiseen molemmat järjestelmät.

Ilmaisimen lämpötila: Useimmissa kaupallisissa spektrofluorometreissä käytetään PMT-koteloita, joita ei ole jäähdytetty, ja itse asiassa monet instrumentit eivät edes tarjoa jäähdytettyä detektorivaihtoehtoa. Jäähdytetty PMT-kotelo voi parantaa instrumentin herkkyyttä vähentämällä tummia määriä (tausta) verrattuna samaan tarkkaan PMT: hen ympäröivässä kotelossa. HORIBAn tavalliset PMT-kotelot FluoroMaxPlus-, Fluorolog3- ja QuantaMaster 8000 -malleissa ovat ympäristön PMT-koteloita, mutta Fluorolog3- ja QuantaMaster 8000 -sarjat tarjoavat kuitenkin valinnaisia jäähdytettyjä PMT-koteloita herkkyyden ja NIR-tunnistuksen parantamiseksi. Vertaamalla modulaarisia tutkimusfluorometrejä, muista verrata kerättyjä tietoja samantyyppisiin PMT-koteloihin (ympäröiviin tai jäähdytettyihin) ja jos ne on jäähdytetty, jäähdytetään sitten samaan lämpötilaan.

Single Versus Double Monochromator: Modular Tutkimusfluorometrien avulla tutkija voi valita yhden tai kahden monokromaattorin joko optisella viritys- tai emissioreitillä. Tässä yhteydessä termi kaksoisvärikromaattori viittaa kahteen dispergoituvaan ritilävaiheeseen yksi toisensa jälkeen, sisääntulorakenteen, välirakon ja ulostulorakenteen kanssa. Kaksoisvärikromaattori voidaan konfiguroida joko lisäaine- tai dispergointitilassa, mutta molemmissa tapauksissa yhden ja kaksoisvärikoneen läpäisykyky ja hajavalon ominaisuudet ovat huomattavasti erilaiset, ja niillä on suuri vaikutus veden Raman-skannauksen SNR: ään, vaikka kaistanleveydet, integraatioajat ja aallonpituudet pidetään vakioina.

Ritilän uratiheys: Ritilän uratiheys vaikuttaa myös spektrofluorometrin läpimenoon ja siten herkkyyteen. Useimmille spektrofluorometreille tämä ei ole liikaa ongelma, koska järjestelmät valmistetaan vain yhdellä erityisellä ritilällä. Tällöin tärkeintä on varmistaa, että kaistanleveydet valitaan samoiksi. Modulaarisilla fluorometreillä voit kuitenkin määrittää yksivärikomponentit eri ritilöillä tai useilla ritilöillä. Näissä järjestelmissä sinun on oltava hyvin varovainen pitääkseen asiat mahdollisimman samankaltaisina. Esimerkiksi kun sinulla on kaksi instrumenttia, joilla on samanlaiset polttovälispektrometrit, ritilän uratiheyden muuttaminen lisää tai vähentää herkkyyttä samalla 5 nm: n kaistanpäästöasetuksella. HORIBA-menetelmässä käytetään ritilöitä, joiden lehtien tiheys on 1200 uraa millimetriä kohti.

Ristikkokulma: Viritys- tai emissiomonokromaattoriksi valitut ritilät tarjoavat optimaalisen läpimenon tietyllä aallonpituusalueella, jota kutsutaan blazeiksi. kulma, koska tämä määräytyy ritiläpinnalle annetun etsauskulman avulla. Sellaisena viritysmonokromaattorina, jossa on 350 nm: n polttama herätevärikromaattori ja 400 nm: n emissiomonokromaattori, olisi optimaalinen valinta saavuttaa paras veden Raman-herkkyys, kun se on jännittävä aallonpituudella 350 nm. Koska useimmat fluorometrit eivät salli ritilän säätämistä, tämä muuttuja ei ole tekijä, mutta niille, jotka sallivat sinun valita ritilät, muista valita ristikot, joissa on sama tai hyvin samanlainen leimakulma, jotta voit tehdä pätevän vertailun .