Méthode expérimentale

Tout comme la formule utilisée pour calculer le rapport signal sur bruit peut avoir un effet dramatique sur le la sensibilité apparente d’un jeu de données spectrales particulier, la configuration matérielle de l’instrument et les paramètres expérimentaux de l’acquisition des données ont également un effet dramatique sur la qualité du spectre acquis.

Il existe de nombreux paramètres matériels, paramètres et options qui ont tous un effet sur la sensibilité mesurée d’un spectrofluoromètre. Cela peut rendre extrêmement difficile la comparaison absolue de la sensibilité relative de deux instruments différents, s’ils ne sont pas utilisés de manière pratiquement identique. Ci-dessous, nous discutons de chacun de ces facteurs et de leur impact sur les données obtenues.

Applicable à tous les fluoromètres à balayage

Longueur d’onde d’excitation: La longueur d’onde d’excitation doit être identique pour tous les systèmes comparés. La méthode HORIBA utilise une excitation de 350 nm pour la bande Raman de l’eau, comme le font la plupart des autres fabricants. Lorsqu’elle est excitée à 350 nm, la bande d’émission Raman pour l’eau a un pic à 397 nm.

Il est heureux que la plupart des fabricants aient normalisé cette longueur d’onde d’excitation, car cela permet une meilleure comparaison. Cependant, il est parfaitement valable de déplacer la longueur d’onde d’excitation vers une autre valeur afin de tester la sensibilité dans une plage de longueurs d’onde différente (par exemple le NIR).

Plage de balayage des émissions: La méthode HORIBA scanne le monochromateur d’émission de 365 à 450 nm, par incréments de 0,5 nm, de manière à collecter l’intégralité du pic Raman à 397 nm ainsi que l’arrière-plan à 450 nm.

Bande passante (Slit Size): La méthode HORIBA utilise une bande passante de 5 nm fentes sur les spectromètres d’excitation et d’émission. Certains fabricants spécifient des fentes de 10 nm ce qui a pour effet d’augmenter la sensibilité par rapport à 5 nm. Il a été rapporté que doubler la taille de la fente physique à l’entrée et à la sortie d’un monochromateur peut quadrupler l’intensité de l’excitation et le débit de détection des émissions puisque le débit va au fur et à mesure que le carré de la taille augmente, mais c’est une estimation simpliste qui doit être mesurée empiriquement. HORIBA a mesuré la différence de facteur avec le HORIBA Fluoromax et a observé que pour Fluoromax, doubler la taille des fentes de 5 à 10 nm augmente le rapport signal sur bruit global pour la bande Raman de l’eau d’un facteur de plus de 3 fois. Cependant, ce sera différent pour tous les fluoromètres, alors assurez-vous de ne pas comparer avec des bandes passantes identiques.

Temps d’intégration (ou temps de réponse): Il s’agit de la durée pendant laquelle le détecteur est autorisé à collecter un signal à un moment donné. position de pas de longueur d’onde. Il joue également un rôle important dans la sensibilité globale mesurée pour un fluoromètre. La méthode HORIBA utilise un temps d’intégration de 1 seconde à chaque point de longueur d’onde, similaire à d’autres fabricants. Cependant, certains fabricants spécifient un temps de réponse de 2 secondes qui augmente le rapport signal / bruit global par presque un facteur de deux. Assurez-vous d’utiliser le même temps d’intégration (réponse) lors de la comparaison.

Type PMT: La plupart des spectrofluoromètres utilisent un tube photomultiplicateur (PMT) comme seul détecteur d’émission de fluorescence, sans aucune option pour changer le boîtier du détecteur. Cela est vrai pour la plupart des fluoromètres analytiques de paillasse. Certains de ces systèmes de paillasse permettent de sélectionner différents PMT individuels avec différentes gammes de longueurs d’onde et spécifications. Les PMT qui ne détectent pas aussi loin dans le NIR que les autres PMT auront un nombre d’obscurité plus faible, de sorte qu’ils fourniront un meilleur rapport signal sur bruit dans la gamme 350 à 400 nm, mais ils peuvent ne pas être utilisables dans toute la longueur d’onde d’émission plage souhaitée pour un laboratoire particulier. Le PMT standard d’HORIBA utilisé dans les séries de fluoromètres FluoroMax Plus, Fluorolog3 et QuantaMaster 8000 est le PMT Hamamatsu R928P, considéré comme le standard de l’industrie pour la fluorométrie. Dans ces cas, assurez-vous que chaque fluoromètre utilise le même PMT, si possible.

Filtres optiques: Un filtre optique peut être ajouté au chemin optique d’un fluoromètre, soit du côté excitation, soit du côté émission de l’échantillon. Ceux-ci peuvent être placés manuellement dans un porte-filtre à l’intérieur du compartiment à échantillon, ou ils peuvent faire partie d’une roue de filtre qui peut placer automatiquement différents filtres dans le chemin optique lorsque différents protocoles expérimentaux sont sélectionnés. Les filtres optiques ont pour effet d’améliorer le rejet de la lumière parasite à des longueurs d’onde données, et ils peuvent considérablement améliorer le rapport signal sur bruit d’un fluoromètre. HORIBA n’utilise aucun filtre optique, autre que les spectromètres à balayage eux-mêmes, lors de la spécification du SNR pour l’eau Raman avec les spécifications des séries Fluoromax, Fluorolog3 ou QuantaMaster 8000.Lorsque vous comparez un fluoromètre HORIBA, avec un fluoromètre qui utilise des filtres automatisés, veuillez ne pas utiliser de filtre, ou s’il est automatique, confirmez la marque et le type de filtres utilisés, et où ils sont utilisés, pour reproduire une méthode expérimentale similaire avec un fluoromètre HORIBA.

Applicable aux fluoromètres de recherche modulaires

Type de détecteur: Les fluoromètres de recherche modulaires comprennent généralement un boîtier PMT en standard, mais permettent de nombreux types de détecteurs à canal unique pour étendre la longueur d’onde gamme, ou gamme de vie de fluorescence d’un instrument. Les détecteurs alternatifs comprennent les boîtiers PMT refroidis, divers détecteurs à semi-conducteurs tels que les InGaAs, les MCP PMT, etc. Ces différents types de détecteurs auront des effets dramatiques sur le rapport signal / bruit de toute mesure d’échantillon particulière, donc ici encore, lorsque vous essayez de comparer la sensibilité d’un fluoromètre à un autre, assurez-vous que le même type de détecteur est utilisé pour collecter des données sur les deux systèmes.

Température du détecteur: La plupart des spectrofluoromètres commerciaux utilisent des boîtiers PMT qui ne sont pas refroidis, et en fait de nombreux instruments n’offrent même pas d’option de détecteur refroidi. Un boîtier PMT refroidi peut améliorer la sensibilité d’un instrument en réduisant les décomptes d’obscurité (arrière-plan) par rapport au même PMT exact dans un boîtier ambiant. Les boîtiers PMT standard de HORIBA dans les FluoroMaxPlus, Fluorolog3 et QuantaMaster 8000 sont des boîtiers PMT ambiants, mais les séries Fluorolog3 et QuantaMaster 8000 offrent des boîtiers PMT refroidis en option pour améliorer la sensibilité et la détection NIR. Lorsque vous comparez des fluoromètres de recherche modulaires, assurez-vous de comparer les données collectées avec le même type de boîtier PMT (ambiant ou refroidi), et s’il est refroidi, puis également refroidi à la même température.

Monochromateur simple ou double: modulaire Les fluoromètres de recherche permettent à un chercheur de sélectionner des monochromateurs simples ou doubles sur le chemin optique d’excitation ou d’émission. Ici, le terme double monochromateur se réfère à deux étages de réseau dispersif, l’un après l’autre, avec une fente d’entrée, une fente intermédiaire et une fente de sortie. Un double monochromateur peut être configuré en mode additif ou dispersif, mais dans les deux cas, les caractéristiques de débit et de lumière parasite d’un monochromateur simple par rapport à un double monochromateur sont très différentes et auront un impact important sur le SNR d’un balayage Raman de l’eau, même si les bandes passantes, les temps d’intégration et les longueurs d’onde sont tous maintenus constants.

Densité de rainure du réseau: La densité de rainure d’un réseau affectera également le débit, et donc la sensibilité d’un spectrofluoromètre. Pour la plupart des spectrofluoromètres, ce n’est pas trop un problème car les systèmes sont fabriqués avec un seul réseau particulier. Dans ce cas, le plus important est de s’assurer que les bandes passantes sont sélectionnées pour être identiques. Cependant, pour les fluoromètres modulaires, vous pouvez configurer les monochromateurs avec différents réseaux ou plusieurs réseaux. Pour ces systèmes, vous devez faire très attention à garder les choses aussi similaires que possible. Par exemple, lorsque vous avez deux instruments dotés de spectromètres à distance focale similaires, la modification de la densité de rainure du réseau augmentera ou diminuera la sensibilité pour le même réglage de bande passante de 5 nm. La méthode HORIBA utilise des réseaux avec une densité de bosquets de 1200 rainures par millimètre.

Angle de flamme du réseau: les réseaux sélectionnés pour un monochromateur d’excitation ou d’émission fournissent un débit optimal à une bande de longueur d’onde particulière, appelée blaze angle puisque celui-ci est déterminé par l’angle de gravure du réseau imparti sur la surface du réseau. En tant que tel, un monochromateur d’excitation avec un monochromateur d’excitation blazé de 350 nm et un monochromateur à émission de 400 nm serait des choix optimaux pour obtenir la meilleure sensibilité Raman de l’eau lors d’une excitation à 350 nm. Étant donné que la plupart des fluoromètres ne vous permettent pas d’ajuster le réseau, cette variable n’est pas un facteur, mais pour ceux qui vous permettent de choisir des réseaux, assurez-vous de choisir des réseaux avec le même angle de flamme ou très similaire pour faire une comparaison valide. .