Introduction

Le transfert horizontal de gène (HGT) entre les cellules bactériennes contribue à l’adaptation bactérienne à divers environnements et, à long terme, à l’évolution bactérienne (Lorenz et Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas et Nielsen, 2005). Cependant, dans les environnements humains, il provoque une propagation indésirable de la pathogénicité, de la résistance aux antibiotiques ou de gènes artificiellement modifiés (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Trois mécanismes de HGT chez les bactéries sont généralement acceptés: la conjugaison, la transduction et la transformation (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). La conjugaison et la transduction impliquent un appareil spécifique pour le transfert d’ADN du donneur aux cellules receveuses; ce sont respectivement des pili conjugatifs et des virions phagiques. La transformation est principalement fonction des cellules réceptrices qui expriment la compétence pour absorber l’ADN nu extracellulaire.

La compétence de transformation peut être induite naturellement ou artificiellement, mais toutes les espèces bactériennes ne développent pas de compétence naturelle (Lorenz et Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). Chez les bactéries naturellement transformables, la compétence est généralement transitoire et induite par des altérations de l’état de croissance de l’organisme (Johnston et al., 2014). Un groupe de «gènes de compétence» a été identifié et des modèles mécanistes généraux ont été proposés (Chen et Dubnau, 2004), bien que des mécanismes précis pour les espèces bactériennes individuelles n’aient pas été suffisamment élucidés (Cameron et Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz et Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska et Gerdes, 2015). Parce que la transformation nécessite de l’ADN nu extracellulaire comme substrat, la sensibilité à la DNase, qui dégrade l’ADN nu, est essentielle pour distinguer la transformation des autres Mécanismes de HGT résistants à la DNase (Lorenz et Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa et Berenguer, 2015).

En général, On ne pense pas qu’Escherichia coli soit naturellement transformable; elle ne développe une compétence génétique élevée que dans des conditions artificielles, y compris une exposition à des concentrations élevées de Ca2 + et un choc thermique (Mandel et Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polyéthylèneglycol traiter ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989) ou un choc électrique (Sambrook et Russell, 2006). Cependant, selon certaines informations, E. coli peut exprimer une compétence modeste dans certaines conditions qui sont réalisables dans son environnement naturel (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . Dans ce qui suit, nous définissons la transformation dans laquelle le plasmide a été ajouté de manière externe en tant que transformation plasmidique (PT) et la transformation dans laquelle l’ADN plasmidique provient de cellules bactériennes mortes (de l’environnement) en tant que transfert de plasmide horizontal par transformation (HPTT).

Escherichia coli semble posséder plusieurs mécanismes d’absorption d’ADN, dont deux populaires: celui qui dépend des «gènes de compétence», qui fonctionnent généralement dans de nombreuses bactéries Gram-négatives et positives (Finkel et Kolter, 2001; Palchevskiy et Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha et Redfield, 2012; Seitz et Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska et Gerdes, 2015). Ce mécanisme est principalement conduit par l’appareil moléculaire spécifique formé autour de la surface cellulaire structure, qui ne traverse les membranes cellulaires que de l’ADN simple brin linéaire produit à l’aide d’une nucléase périplasmique spécifique. Chez E. coli, ces gènes ne sont pas considérés comme contribuant à la PT car la PT nécessite l’absorption de doubles-s intacts ADN circulaire tranded (Sinha et Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Par conséquent, il est peu probable que ce mécanisme contribue au PT dans l’environnement. Le deuxième mécanisme est celui qui dépend de facteurs environnementaux externes, tels que les ions métalliques divalents, les chocs thermiques et les contraintes physiques (Mandel et Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Ces stimuli sont généralement considérés comme induisant la formation de structures de type pore dans la surface cellulaire pour le passage d’ADN double brin intact, y compris des plasmides circulaires, bien que les détails restent flous (Reusch et al., 1986; Reusch et Sadoff, 1988; Huang et Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Les ions Ca2 + et Mg2 + sont les facteurs d’induction de compétence les plus typiques. Les habitats environnementaux contiennent souvent plusieurs millimolaires de ces ions, dont les concentrations sont suffisantes pour induire une compétence faible mais détectable chez E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Par conséquent, ce mécanisme est possible dans l’environnement extérieur aux laboratoires. En plus des deux mécanismes ci-dessus, un autre mécanisme a été proposé par Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) et Sun (2016), dans lesquels un transporteur ABC et des protéines spécifiques de la membrane périplasmique et interne sont impliqués. Ce mécanisme est régulé par les régulateurs transcriptionnels internes, RpoS et CRP, il a donc été suggéré que ce mécanisme est également un processus naturel génétiquement contrôlé.

Dans cette mini revue, nous résumons nos études sur HGT utilisant E. coli systèmes expérimentaux et discuter de l’occurrence possible d’une transformation par de multiples mécanismes dans des environnements naturels et de son impact possible sur la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques.

Transformation plasmidique d’E. coli dans des conditions imitant l’environnement naturel

PT dans les extraits alimentaires

Les aliments humains sont d’excellents milieux de culture pour de nombreuses bactéries. Cependant, peu d’attention a été accordée aux effets des aliments sur la physiologie bactérienne autres que la croissance et la survie. Nous avons étudié la possibilité que les aliments agissent comme des milieux de transformation bactérienne. Les aliments contiennent souvent des concentrations millimolaires d’ions métalliques divalents (Ca2 + et Mg2 +) et sont souvent conservés dans un réfrigérateur ou un congélateur, suivis d’un réchauffement rapide (c.-à-d. Choc thermique). Ces conditions sont propices au développement de la compétence chez E. coli (Mandel et Higa, 1970; Huang et Reusch, 1995; Baur et al., 1996); comme E. coli est un contaminant alimentaire courant, il est intéressant de déterminer s’il peut être transformé en aliments. Certains aliments peuvent en effet agir comme des supports induisant une compétence chez E. coli (Maeda et al., 2003). Sur 42 échantillons d’aliments testés, > 10 ont montré une capacité à induire la compétence à une fréquence de 10−7−10−9. Parmi ceux-ci, le surnageant du tofu (un aliment de type fromage à base de lait de soja caillé) a présenté l’activité la plus élevée (une sur 10−7−10−8 cellules receveuses), correspondant à environ la moitié de l’efficacité obtenue avec 100 mM CaCl2. Cependant, il n’y avait pas de corrélation claire entre les fréquences de transformation et les caractéristiques chimiques des aliments (concentrations et pH de Ca2 + ou Mg2 +), ce qui suggère que des facteurs complexes au sein des aliments affectent le développement des compétences. Des effets similaires des aliments pour induire la transformation ont été signalés chez E. coli (Bauer et al., 1999) et Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT in Biofilm solide-air

De nombreuses bactéries existent sous forme de biofilms dans les environnements naturels et artificiels (Davey et O’Toole, 2000). Les biofilms sont des agrégats de microbes qui se forment aux interfaces solide-liquide ou solide-air (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Les cellules de ces cultures à haute densité interagissent les unes avec les autres et expriment des fonctions physiologiques distinctes par rapport à leurs formes planctoniques libres. Des études antérieures sur la transformation d’E. Coli se sont exclusivement concentrées sur les cellules planctoniques (Mandel et Higa, 1970; Hanahan, 1983), mais nous avons montré que les cellules d’E. Coli dans les biofilms SA développent des compétences à une fréquence de 10−6−10−8 sur divers les milieux solides, y compris la gélose LB et H2O et divers aliments humides (Maeda et al., 2004). Les cellules vivantes coexistent généralement avec les cellules mortes dans les biofilms, et ces dernières peuvent libérer leur ADN et certains ions métalliques divalents, y compris Ca2 + et Mn2 +, dans le microenvironnement local du biofilm (Davey et O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Ces conditions peuvent être propices au développement de la transformation et peuvent ne pas être exclusives aux biofilms SA puisqu’une amélioration similaire des biofilms air-liquide d’E. Coli a également été signalée (Król et al., 2011).

PT des souches d’E. Coli sauvages dans l’eau

Nos résultats et ceux d’autres suggèrent que E. coli environnemental peut potentiellement acquérir de l’ADN étranger par transformation. Cependant, il existe peu de rapports antérieurs d’enquête sur la transformabilité des souches naturelles d’E. Coli (Woegerbauer et al., 2002; Sinha et Redfield, 2012). Par conséquent, nous avons examiné le potentiel des souches naturelles d’E. Coli à développer des compétences dans des conditions environnementales. Nous avons utilisé une collection standard de souches d’E. Coli de référence (ECOR) comme modèle d’E. Coli naturel (Ochman et Selander, 1984) car ces souches ECOR ont été largement utilisées dans diverses études sur la physiologie, le comportement et la variation génotypique de E. coli naturel (Tenaillon et al., 2010). Nous avons constaté que certaines souches ECOR présentaient une transformabilité détectable (10−10−10−11) dans l’eau naturelle (eau pure naturelle en bouteille disponible dans le commerce) à des températures constantes et variables entre 5 et 35 ° C et à des températures hivernales dans une expérience sur le terrain, suggérant que E. coli naturel peut potentiellement développer des compétences dans certaines conditions qui pourraient se produire dans l’environnement (Matsumoto et al., 2016b).

Transfert horizontal de plasmide par transformation dans E. coli

HPTT induit par la congélation-décongélation dans les eaux naturelles et les extraits alimentaires

Dans l’environnement, l’ADN nu peut être naturellement fourni par les cellules mortes aux cellules voisines dans le même habitat ou micro-environnement.Par conséquent, il vaut la peine d’étudier la possibilité de HPTT dans un système fermé dans certaines conditions réalisables. La congélation-décongélation est un processus courant dans la manipulation des denrées alimentaires et se produit également dans la nature. Le traitement par congélation-décongélation des cellules d’E. Coli peut favoriser la fuite d’ADN des cellules mortes et l’absorption subséquente par les cellules survivantes parce qu’elles répondent au choc thermique, entraînant une transformation in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Ce traitement de suspensions condensées de souches mixtes d’E. Coli dans des eaux naturelles et des extraits alimentaires a provoqué un transfert latéral in situ de plasmides non conjugatifs à une fréquence de 10−8−10−10 (Ishimoto et al., 2008). Ce phénomène s’est également produit même après 1 à 2 mois de stockage à -20 ° C, et sa sensibilité à la DNase a démontré qu’il était médié via un mécanisme de transformation.

Basse fréquence de HPTT dans les biofilms SA

Les biofilms sont considérés comme des environnements appropriés pour la transformation in situ parce que les cellules vivantes et mortes coexistent à proximité, et l’ADN libéré des cellules mortes s’accumule souvent autour des cellules vivantes. De plus, comme décrit ci-dessus, parce que les cellules d’E. Coli peuvent développer une compétence modeste dans les biofilms SA (Maeda et al., 2004), ces deux facteurs contribuent au HPTT dans les biofilms. En co-cultivant simplement une souche sans plasmide avec une souche hébergeant un plasmide non conjugatif dans un biofilm SA sur un milieu gélosé sans antibiotique, les cellules transformées ont été produites à basse fréquence (10−9−10−10) en 24–48 h (Maeda et al., 2006). Les cultures liquides des mêmes souches dans le bouillon LB ont produit peu ou pas de transformants, ce qui suggère l’importance de la formation de biofilm SA pour le transfert de plasmide. Essentiellement, le même phénomène s’est produit dans les biofilms SA sur des milieux alimentaires (Ando et al., 2009). Ce phénomène s’est également produit entre des souches de laboratoire populaires telles que DH5, HB101 et MG1655 (Etchuuya et al., 2011), qui sont lysogéniques sans phage et sans appareil de conjugaison, ce qui suggère que la faible fréquence de transfert horizontal de plasmide dans les biofilms SA peut se produisent sans l’aide de phages ou de machines de conjugaison et, par conséquent, que ce transfert d’ADN est dû à une sorte de transformation. Cependant, comme la mutation rpoS− n’a pas affecté ce HPTT (Maeda et al., 2006), il est peu probable que le mécanisme dépendant de RpoS (Zhang et al., 2012) soit impliqué.

Haute fréquence de HPTT Induit par le phage P1

En évaluant les combinaisons de plusieurs souches et plasmides pour le transfert horizontal de plasmide, la souche E. coli CAG18439 s’est avérée agir à la fois comme donneur de plasmide et receveur de plasmide en combinaison avec le plasmide pHSG299 et pourrait fréquemment transférer le plasmide dans une culture cellulaire mixte même en milieu liquide (Etchuuya et al., 2011). Ce HGT s’est avéré être un type de transformation car le transfert de plasmide à haute fréquence (10−5−10−8) était sensible à la DNase. D’autres études ont révélé que ce phénomène présente certaines caractéristiques spécifiques: (1) promotion par le facteur protéinique libéré par CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) promotion par une séquence de 88 pb sur pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) fréquence de transfert élevée (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); et (4) la dépendance à des gènes spécifiques (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). En ce qui concerne (1), une étude ultérieure a révélé que ces facteurs protéiniques comprennent une particule de phage P1vir (ou un dérivé de celle-ci) et que le phage P1vir ajouté de manière externe peut reproduire le transfert de plasmide horizontal entre les cellules d’E. Coli et les trois autres caractéristiques majeures de CAG18439 – HPTT dépendant (Sugiura et al., 2017). Ce phénomène était également largement sensible à la DNase, suggérant qu’une grande partie de ce transfert de plasmide est due à la transformation malgré l’implication du phage P1. Le mécanisme de transformation du transfert plasmidique induit par le phage P1vir peut être dû à une infection phagique ou à un réveil spontané du phage lysogénéisé dans des cellules hébergeant un plasmide, conduisant à la lyse cellulaire et à la libération ultérieure d’ADN plasmidique intracellulaire sous une forme utilisable pour la transformation. Bien qu’un tel mécanisme soit généralement réalisable, il en a été peu démontré clairement dans E. coli. Une étude récente de Keen et al. (2017) utilisant un autre système phagique a également démontré un mécanisme de transformation induit par phage similaire chez E. coli. Cependant, le HPTT par P1vir ou CAG18439 ne peut pas être correctement expliqué uniquement par un apport d’ADN amélioré à partir de la lyse cellulaire induite par les phages, et il diffère de la simple transformation chez E. coli (Hanahan, 1983) en termes de ses caractéristiques distinctives (2–4). En ce qui concerne (2), la séquence de 88 pb sur pHSG299 n’est pas homologue à la partie de la séquence du génome du phage P1. Cette séquence se trouve souvent dans les bases de données parmi les séquences générales de vecteurs de clonage mais pas dans aucune source naturelle. En retraçant le processus de construction de pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), nous soupçonnons cependant que la séquence de 88 pb provient de R6-5, un plasmide R conjugatif.Cette séquence, et des éléments d’ADN similaires, peuvent contribuer au HPTT de R et d’autres plasmides dans l’environnement. En ce qui concerne (3), ce transfert à haute fréquence ne peut pas être expliqué par la simple capacité PT de CAG18439 et d’autres souches utilisées parce que la PT simple dans ces souches dans des conditions de culture équivalentes était 105-102 fois moins fréquente (Etchuuya et al., 2011). Il a donc été suggéré qu’un facteur protéinique dérivé du CAG18439, d’une taille estimée entre 9 et 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) pourrait également être impliqué dans la promotion du HPTT. Ce facteur aide vraisemblablement à l’absorption d’ADN par les cellules receveuses, probablement en combinaison avec la séquence de 88 pb sur l’ADN transformant. Enfin, en ce qui concerne (4), des études ultérieures de criblage à l’échelle du génome pour les gènes receveurs impliqués dans le HPTT ont suggéré que plusieurs gènes participent au mécanisme (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Ceux-ci comprennent ceux qui n’ont pas été signalés comme étant impliqués dans la transformation naturelle ou artificielle d’E. Coli (comme rodZ) et quelques homologues de gènes de compétence connus, tels que ybaV et yhiR (Finkel et Kolter, 2001; Palchevskiy et Finkel, 2006 ), mais n’incluent pas rpoS et d’autres gènes liés au mécanisme dépendant de RpoS (Zhang et al., 2012). Dans l’ensemble, ces résultats pointent vers un mécanisme inconnu et complexe de HPTT haute fréquence induit par phages qui pourrait partager en partie la voie de transformation naturelle.

HPTT entre souches naturelles d’E. Coli

Pour évaluer davantage la généralité et la variété du HPTT dans les souches d’E. Coli, des souches naturelles (les souches ECOR susmentionnées) ont été utilisées dans une étude de HPTT. Plusieurs combinaisons de souches ECOR ont été co-cultivées dans des milieux liquides, ce qui a entraîné un transfert horizontal sensible à la DNase de gènes naturels de résistance aux antibiotiques (Matsumoto et al., 2016a, b). L’isolement plasmidique de ces nouveaux transformants a démontré un transfert de plasmide horizontal entre les souches ECOR (Matsumoto et al., 2016a, b). Des expériences PT simples utilisant les mêmes souches ECOR ont révélé que le HPTT se produit beaucoup plus fréquemment (10−6−10−8) que le PT simple (inférieur à 10−10) dans les mêmes conditions de culture, ce qui suggère que le HPTT est unique et efficace. De plus, nous avons découvert que 6 des 12 combinaisons des souches ECOR, dont certaines ne produisent pas de phages formant des plaques (Shibata et al., 2014b), présentaient un transfert de gène sensible à la DNase, ce qui nous amène à soupçonner que le HPTT est plutôt commun chez les Souches d’E. Coli. Dans l’ensemble, ces données suggèrent que certains mécanismes de transformation sans phage et sans conjugaison existent également naturellement dans certaines souches d’E. Coli et que HPTT de plasmides naturels résistants aux antibiotiques (tels que les plasmides de la souche ECOR24: numéros d’accès AB905284 et AB905285) peut être une voie de production de cellules d’E. Coli naturelles multirésistantes aux médicaments.

Mécanismes possibles et faisabilité de PT et HPTT dans E. coli dans l’environnement

Exemples de PT et Les HPTT induits par le gel-dégel et à basse fréquence introduits dans cette mini-revue sont probablement plus liés au mécanisme de formation des pores qu’au mécanisme de compétence dépendant du gène, car les aliments et les eaux naturelles contiennent souvent des niveaux mM d’ions Ca2 + et Mg2 + (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), et l’environnement du biofilm fournit aux cellules vivantes le contenu de cellules mortes, y compris les ions métalliques divalents et l’ADN plasmidique transformable. Comme nous l’avons décrit précédemment (Maeda et al., 2006), un biofilm SA (diamètre, 10–12 mm; épaisseur, 0,5–0,8 mm) contient environ 2–5 × 109 cellules. De plus, les bactéries intestinales chez les mammifères représentent généralement environ 1011 cellules / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Compte tenu de l’énorme échelle de l’environnement, même les fréquences de transformation de 10−9−10−10 ne peuvent pas être sous-estimées car elles auront un impact sur les populations de bactéries.

Le HPTT à haute fréquence décrit dans cet article peut impliquer non seulement le mécanisme de formation des pores, mais aussi une partie des fonctions du gène de compétence et éventuellement un autre mécanisme inconnu, comme mentionné ci-dessus. Comme les bactériophages sont l’un des organismes les plus abondants dans la biosphère et omniprésents dans l’environnement (Clokie et al., 2011), le HPTT induit par les phages est également considéré comme réalisable dans l’environnement, ainsi que la transduction ordinaire et d’autres dérivés de phages. méthodes de HGT, par exemple, les agents de transfert de gène (Lang et al., 2012).

Conclusion et perspective

Dans l’ensemble, nos résultats et les données précédentes associées indiquent que de multiples mécanismes induisent une transformation. type HGT dans E. coli en fonction de diverses circonstances environnementales et cellulaires telles que la nature du milieu (par exemple, l’eau et la nourriture), une température variable de moins de zéro à -40 ° C, une densité cellulaire élevée dans les biofilms et des antécédents génétiques variés des souches impliquées. La contribution du HGT de type transformation à la dynamique génétique dans l’environnement peut être sous-estimée (Bushman, 2002; Thomas et Nielsen, 2005), et nos études indiquent que le HPTT chez E.coli se produit à des fréquences de transfert substantielles (10−5−10−10) dans les conditions qui peuvent être rencontrées dans l’environnement. Par conséquent, le HGT de type transformation peut contribuer à la propagation de gènes de résistance aux antibiotiques et à l’émergence de bactéries multirésistantes dans l’environnement réel en dehors des laboratoires. Des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre le rôle précis et la contribution du HGT de type transformation dans la propagation de la résistance aux antibiotiques.

Contributions des auteurs

HH, ES et SM ont rédigé l’article.

Financement

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Enago (www.enago.jp) pour l’anglais services d’édition et de relecture.