Bevezetés

A baktériumsejtek közötti horizontális géntranszfer (HGT) hozzájárul a baktériumok alkalmazkodásához a különböző környezetekhez és hosszú távon a baktériumok evolúciójához (Lorenz és Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas és Nielsen, 2005). Emberi környezetben azonban a patogenitás, az antibiotikum-rezisztencia vagy a mesterségesen megtervezett gének nem kívánt terjedését okozza (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly és mtsai, 2009a, b). A baktériumok HGT három mechanizmusa általánosan elfogadott: konjugáció, transzdukció és transzformáció (Bushman, 2002; von Wintersdorff és mtsai, 2016). A konjugáció és transzdukció magában foglalja a donor és a recipiens sejt közötti DNS-transzfer speciális készülékét; ezek konjugatív pili és fág virionok. A transzformáció elsősorban a befogadó sejtek függvénye, amelyek kifejezik az extracelluláris meztelen DNS felvételének kompetenciáját.

A transzformációs kompetencia természetes vagy mesterséges úton kiváltható, de nem minden baktériumfaj fejleszti ki a természetes kompetenciát (Lorenz és Wackernagel, 1994; Johnston és mtsai., 2014). A természetesen transzformálható baktériumoknál a kompetencia általában átmeneti és a szervezet növekedési állapotának változásai indukálják (Johnston et al., 2014). Meghatározták a “kompetencia gének” csoportját, és általános mechanisztikus modelleket javasoltak (Chen és Dubnau, 2004), bár az egyes baktériumfajok pontos mechanizmusait nem sikerült megfelelően megvilágítani (Cameron és Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz és Blokesch, 2013; Johnston és mtsai, 2014; Jaskólska és Gerdes, 2015). Mivel a transzformációhoz extracelluláris meztelen DNS szükséges, mint szubsztrátum, a meztelen DNS-t lebontó DNáz-érzékenység kulcsfontosságú a transzformáció megkülönböztetésében DNáz-rezisztens HGT mechanizmusok (Lorenz és Wackernagel, 1994; Giovanetti és mtsai, 2005; Marshall és mtsai, 2010; Rohrer és mtsai, 2012; Blesa és Berenguer, 2015).

Általában Az Escherichia coli nem hiszem, hogy természetesen transzformálható; magas mesterséges kompetenciát csak mesterséges körülmények között fejleszt ki, beleértve a magas Ca2 + koncentrációnak való kitettséget és a hőmérsékleti sokkot (Mandel és Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polietilénglikol csemege (Chung és mtsai, 1989; Sambrook és mtsai., 1989), vagy elektromos sokk (Sambrook és Russell, 2006). Állítólag azonban az E. coli szerény kompetenciát fejezhet ki bizonyos körülmények között, amelyek megvalósíthatók a természetes környezetében (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . A következőkben definiáljuk azt a transzformációt, amelyben a plazmidot külsőleg plazmidtranszformációként (PT) adtuk hozzá, és azt a transzformációt, amelyben a plazmid DNS elhalt baktériumsejtekből származik (a környezetből), horizontális plazmidtranszferként transzformációval (HPTT).

Úgy tűnik, hogy az Escherichia coli több DNS-felvételi mechanizmussal rendelkezik, köztük két népszerű mechanizmussal: az egyik a “kompetenciagénektől” függ, amelyek általában sok gram-negatív és -pozitív baktériumban működnek (Finkel és Kolter, 2001; Palchevskiy és Finkel, 2006; Sinha és mtsai, 2009; Sinha és Redfield, 2012; Seitz és Blokesch, 2013; Johnston és mtsai, 2014; Jaskólska és Gerdes, 2015). Ezt a mechanizmust főként a sejtfelszín körül kialakult specifikus molekuláris berendezés végzi szerkezet, amely a sejtmembránokon keresztül csak egy adott egy periplazmatikus nukleáz alkalmazásával előállított egyszálú DNS-t halad át. E. coliban ezek a gének nem tekinthetők hozzájárulnak a PT-hez, mivel a PT megköveteli az ép kettős sejtek felvételét. láncolt körkörös DNS (Sinha és Redfield, 2012; Johnston és mtsai., 2014). Ezért nem valószínű, hogy ez a mechanizmus hozzájárulna a környezeti PT-hez. A második mechanizmus a külső környezeti tényezőktől függ, például a kétértékű fémionoktól, a hősokktól és a fizikai igénybevételtől (Mandel és Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Ezeket az ingereket általában úgy tekintik, hogy pórusszerű struktúrák képződését indukálják a sejtfelületben az ép kettős szálú DNS, beleértve a kör alakú plazmidokat is, átjutása érdekében, bár a részletek továbbra sem tisztázottak (Reusch et al., 1986; Reusch és Sadoff, 1988; Huang és Reusch, 1995; Sun és mtsai, 2013; Asif és mtsai, 2017). A kompetencia-indukáló faktorok a Ca2 + és Mg2 + ionok. A környezeti élőhelyek gyakran tartalmaznak több millimól ilyen iont, amelyek koncentrációja elegendő ahhoz, hogy gyenge, de kimutatható kompetenciát indukáljon az E. coliban (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Ezért ez a mechanizmus a laboratóriumokon kívüli környezetben lehetséges. A fenti két mechanizmus mellett egy másik mechanizmust javasoltak Sun és mtsai. (2006, 2009), Zhang és mtsai. (2012), Guo és mtsai.(2015) és Sun (2016), amelyekben ABC transzporter, valamint specifikus periplazmatikus és belső membránfehérjék vesznek részt. Ezt a mechanizmust belső transzkripciós szabályozók, az RpoS és a CRP szabályozzák, ezért felvetették, hogy ez a mechanizmus genetikailag kontrollált természetes folyamat is.

Ebben a mini áttekintésben összefoglaljuk a HGT-vel kapcsolatos vizsgálatainkat E. coli felhasználásával. kísérleti rendszerek, és megvitatják a transzformáció lehetséges előfordulását több mechanizmus segítségével a természetes környezetben és annak lehetséges hatását az antibiotikum-rezisztencia gének terjedésére.

E. coli plazmid transzformációja a természetes környezetet utánzó körülmények között

PT az élelmiszer-kivonatokban

Az emberi ételek sok baktérium számára kiváló táptalajok. Kevés figyelmet szenteltek azonban az élelmiszereknek a növekedésen és a túlélésen kívüli egyéb, a baktériumélettanra gyakorolt hatásaira. Megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy az élelmiszerek a baktériumok átalakulásának közegeként működjenek. Az ételek gyakran tartalmaznak millimoláris koncentrációjú kétértékű fémionokat (Ca2 + és Mg2 +), és gyakran hűtőszekrényben vagy fagyasztóban tárolják őket, majd gyors felmelegedés következik (vagyis hősokk). Ezek a körülmények kedveznek a kompetencia fejlődésének az E. coliban (Mandel és Higa, 1970; Huang és Reusch, 1995; Baur és mtsai, 1996); mivel az E. coli gyakori élelmiszer-szennyeződés, érdekes meghatározni, hogy átalakulhat-e az élelmiszerekben. Bizonyos ételek valóban médiumként működhetnek, amelyek kompetenciát indukálnak az E. coliban (Maeda et al., 2003). A 42 vizsgált élelmiszerminta közül > 10 képes volt kompetenciát kiváltani 10−7−10−9 gyakorisággal. Ezek közül a tofu felülúszója (túrós szójatejből készült sajtszerű étel) mutatta a legnagyobb aktivitást (10–7–10–8 befogadó sejtből egy), ami a 100 mM-mel elért hatékonyság körülbelül felének felel meg. CaCl2. Az ételek átalakulási gyakorisága és kémiai jellemzői (Ca2 + vagy Mg2 + koncentráció és pH) között azonban nem volt egyértelmű összefüggés, ami arra utal, hogy az élelmiszereken belüli összetett tényezők befolyásolják a kompetencia fejlődését. Az ételek hasonló hatásait az átalakulás indukálásában az E. coli (Bauer et al., 1999) és a Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998) esetében jelentették.

PT in Szilárd levegős biofilm

Számos baktérium létezik biofilmként természetes és mesterséges környezetben (Davey és O’Toole, 2000). A biofilmek olyan mikrobák együttesei, amelyek szilárd-folyadék vagy szilárd-levegő (SA) határfelületeken képződnek (Anderl és mtsai, 2000; Carmen és mtsai, 2004). A sejtek ezekben a nagy sűrűségű kultúrákban kölcsönhatásba lépnek egymással, és megkülönböztető élettani funkciókat fejeznek ki a szabad plankton formájukhoz képest. Az E. coli transzformációval kapcsolatos korábbi vizsgálatok kizárólag a planktonikus sejtekre összpontosítottak (Mandel és Higa, 1970; Hanahan, 1983), de kimutattuk, hogy az SA biofilmeken belüli E. coli sejtek 10−6−10−8 gyakorisággal fejlesztik a kompetenciát különböző szilárd táptalaj, beleértve az LB és H2O agart és különféle nedves ételeket (Maeda et al., 2004). Az élő sejtek általában együtt élnek az elhalt sejtekkel a biofilmekben, és ezek felszabadíthatják a DNS-t és bizonyos kétértékű fémionjaikat, köztük a Ca2 + és Mn2 + a biofilm helyi mikrokörnyezetébe (Davey és O’Toole, 2000; Whitchurch és mtsai, 2002 ). Ezek a körülmények elősegíthetik a transzformáció fejlődését, és nem lehetnek kizárólagosak az SA biofilmek számára, mivel az E. coli levegő-folyadék biofilmek hasonló növekedéséről is beszámoltak (Król et al., 2011).

A vad E. coli törzsek vízben lévő PT

Saját és mások eredményeink szerint a környezeti E. coli transzformáció révén potenciálisan megszerezhet idegen DNS-t. A természetes E. coli törzsek transzformálhatóságáról azonban kevés korábbi jelentés készült (Woegerbauer et al., 2002; Sinha és Redfield, 2012). Ezért megvizsgáltuk a természetes E. coli törzsek lehetőségeit a kompetencia fejlesztésére környezeti feltételek mellett. A standard E. coli referencia-törzsek (ECOR) törzseit használtuk a természetes E. coli modelleként (Ochman és Selander, 1984), mert ezeket az ECOR-törzseket széles körben alkalmazták a természetes E. coli (Tenaillon et al., 2010). Megállapítottuk, hogy néhány ECOR törzs kimutatható transzformálhatóságot mutatott (10-10-10-10) természetes vízben (kereskedelmi forgalomban kapható palackozott természetes tiszta víz) állandó és változó hőmérsékleten 5 és 35 ° C között, valamint téli hőmérsékleten egy terepi kísérletben, ami arra utal, hogy hogy a természetes E. coli kompetenciát fejleszthet bizonyos körülmények között, amelyek megvalósíthatók a környezetben (Matsumoto és mtsai., 2016b).

Horizontális plazmid transzformáció transzformációval E. coliban

Fagyás-olvadás által kiváltott HPTT természetes vizekben és élelmiszer-kivonatokban

A környezetben meztelen DNS természetes úton juttatható el az elhalt sejtektől a szomszédos sejtekhez ugyanazon élőhelyen vagy mikrokörnyezetben.Ezért érdemes kivizsgálni a HPTT lehetőségét zárt rendszerben, bizonyos megvalósítható feltételek mellett. A fagyás-olvadás az élelmiszerek kezelésében általános folyamat, és a természetben is előfordul. Az E. coli sejtek fagyasztott és olvadó kezelése elősegítheti az elhalt sejtekből történő DNS szivárgást és a túlélő sejtek későbbi felvételét, mert reagálnak a hősokkra, ami in situ transzformációt eredményez (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). A kevert E. coli törzsek természetes vizekben és élelmiszer-kivonatokban lévő kondenzált szuszpenzióinak ez a kezelése a nem konjugatív plazmidok in situ laterális transzferjét okozta 10-8-10-10 frekvencián (Ishimoto et al., 2008). Ez a jelenség 1-2 hónapos -20 ° C-on történő tárolás után is jelentkezett, és a DNase-re való érzékenysége azt mutatta, hogy egy transzformációs mechanizmus közvetítette.

A HPTT alacsony frekvenciája az SA Biofilmekben

Úgy gondolják, hogy a biofilmek alkalmasak az in situ transzformációra, mivel az élő és az elhalt sejtek egymás közelében élnek, és az elhalt sejtekből felszabaduló DNS gyakran felhalmozódik az élő sejtek körül. Ezen túlmenően, amint azt a fentiekben leírtuk, mivel az E. coli sejtek mérsékelt kompetenciát tudnak kifejleszteni az SA biofilmekben (Maeda és mtsai., 2004), mindkét tényező hozzájárul a biofilmek HPTT-jéhez. Egy plazmidmentes törzs egyszerű tenyésztésével egy nem konjugatív plazmiddal egy SA biofilmben, antibiotikummentes agar táptalajon, transzformált sejteket állítottunk elő alacsony frekvencián (10–9-10–10) 24–48 órán belül. (Maeda et al., 2006). Az azonos törzsek folyékony tenyészetei az LB táptalajban nem vagy csak kevés transzformánst eredményeztek, ami arra utal, hogy az SA biofilm képződik a plazmid transzfer szempontjából. Lényegében ugyanez a jelenség fordult elő az élelmiszer-alapú táptalajok SA biofilmjeiben is (Ando és mtsai, 2009). Ez a jelenség olyan népszerű laboratóriumi törzsek között is előfordult, mint a DH5, HB101 és MG1655 (Etchuuya et al., 2011), amelyek lizogén fágmentesek és konjugatív készülékek mentesek, ami arra utal, hogy az SA biofilmek horizontális plazmidtranszferjének alacsony frekvenciája fág vagy konjugációs gépezet nélkül történhetnek, és ezért ez a DNS-transzfer egyfajta transzformációnak köszönhető. Mivel azonban az rpoS – mutáció nem befolyásolta ezt a HPTT-t (Maeda et al., 2006), az RpoS-függő mechanizmus (Zhang és mtsai, 2012) valószínűleg nem fog bekapcsolódni.

A HPTT magas gyakorisága A P1 Phage indukálta

Több törzs és plazmid kombinációinak kiértékelésével a horizontális plazmid transzfer érdekében az E. coli CAG18439 törzsről kiderült, hogy mind a plazmid donor, mind a plazmid befogadója a pHSG299 plazmiddal kombinálva. folyékony táptalajban gyakran kevert sejttenyészetbe tudta vinni a plazmidot (Etchuuya et al., 2011). Kimutatták, hogy ez a HGT egyfajta transzformáció, mivel a nagyfrekvenciás plazmid transzfer (10−5-10–8) DNáz-érzékeny volt. További vizsgálatok azt mutatták, hogy ez a jelenség néhány sajátos jellemzővel rendelkezik: (1) a CAG18439-ből felszabaduló fehérjetartalmú faktor elősegítése (Etchuuya et al., 2011); (2) promóció 88 bp szekvenciával pHSG299-en (Sobue és mtsai., 2011); (3) nagy átviteli frekvencia (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); és (4) függőség a specifikus génektől (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Az (1) vonatkozásában egy későbbi tanulmány kimutatta, hogy ezek a fehérjetartalmú tényezők tartalmazzák a P1vir fág részecskét (vagy annak származékát), és hogy a külsőleg hozzáadott P1vir fág képes reprodukálni az E. coli sejtek és a CAG18439 három másik fő jellemzője közötti horizontális plazmid transzfert -függő HPTT (Sugiura et al., 2017). Ez a jelenség szintén nagyrészt DNáz-érzékeny volt, ami arra utal, hogy ennek a plazmidtranszfernek a nagy része a transzformációnak köszönhető, a P1 fág bevonása ellenére. A P1vir fág által indukált plazmidtranszformáció transzformációs mechanizmusa lehet a fágfertőzés vagy a lizogenizált fág spontán felébredése plazmidot hordozó sejtekben, ami sejtlízishez és az azt követő intracelluláris plazmid DNS felszabaduláshoz vezet transzformáláshoz. Bár egy ilyen mechanizmus általában kivitelezhető, az E. coliban kevés egyértelmű bizonyítást nyert. Keen és munkatársai nemrégiben készült tanulmánya. (2017) más fágrendszert alkalmazva szintén hasonló fág-indukált transzformációs mechanizmust mutatott ki E. coliban. A P1vir vagy a CAG18439 által készített HPTT azonban nem magyarázható el csak a fág által indukált sejtlízis fokozott DNS-ellátásával, és megkülönböztető jellemzői (2–4) tekintetében különbözik az E. coliban végzett egyszerű transzformációtól (Hanahan, 1983). A (2) pont tekintetében a pHSG299-en lévő 88 bp-os szekvencia nem homológ a P1 fággenom-szekvencia részével. Ez a szekvencia gyakran megtalálható az adatbázisokban az általános klónozó vektor szekvenciák között, de egyetlen természetes forrásnál sem. A pHSG299 (Hashimoto-Gotoh és mtsai, 1981; Brady és mtsai, 1984; Takeshita és mtsai, 1987) felépítésének nyomon követésével arra gyanakszunk, hogy a 88 bp-os szekvencia az R6-5-ből származik, konjugatív R plazmid.Ez a szekvencia és hasonló DNS-elemek hozzájárulhatnak az R és más plazmidok HPTT-jéhez a környezetben. A (3) vonatkozásában ez a nagyfrekvenciás átvitel nem magyarázható a CAG18439 és más használt törzsek egyszerű PT képességével, mivel az egyszerű PT ezekben a törzsekben egyenértékű tenyésztési körülmények között 105-102-szer ritkább volt (Etchuuya et al. 2011). Ezért azt javasolták, hogy egy CAG18439-ből származó fehérjetényező, amelynek mérete 9 és 30 kDa között van (Etchuuya et al., 2011), szintén szerepet játszhat a HPTT elősegítésében. Ez a faktor feltehetően segíti a befogadó sejtek DNS-felvételét, valószínűleg a transzformáló DNS 88 bp-os szekvenciájával kombinálva. Végül, ami a (4) pontot illeti, a HPTT-ben részt vevő befogadó gének későbbi, genomszéles szűrővizsgálatai azt sugallták, hogy több gén vesz részt a mechanizmusban (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Ide tartoznak azok, amelyekről nem számoltak be, hogy természetes vagy mesterséges transzformációban vesznek részt az E. coliban (például rodZ), és néhány ismert kompetencia génhomológ, például az ybaV és az yhiR (Finkel és Kolter, 2001; Palchevskiy és Finkel, 2006) ), de nem tartalmazzák az rpoS-t és az RpoS-függő mechanizmushoz kapcsolódó egyéb géneket (Zhang et al., 2012). Összességében ezek az eredmények a fág által kiváltott, nagyfrekvenciás HPTT ismeretlen, összetett mechanizmusa felé mutatnak, amely részben megoszthatja a természetes átalakulás útját.

HPTT a természetes E. coli törzsek között

A HPTT általánosságának és változatosságának további értékeléséhez E. coli törzsekben természetes törzseket (a fent említett ECOR törzseket) használtunk a HPTT vizsgálatában. Az ECOR törzsek számos kombinációját együtt tenyésztettük folyékony táptalajban, ami a természetes antibiotikum-rezisztencia gének DNáz-érzékeny horizontális transzferjét eredményezte (Matsumoto et al., 2016a, b). Az új transzformánsok plazmid-izolálása horizontális plazmidtranszfert mutatott az ECOR törzsek között (Matsumoto és mtsai, 2016a, b). Az ugyanazon ECOR törzseket alkalmazó egyszerű PT kísérletek azt mutatták, hogy a HPTT sokkal gyakrabban fordul elő (10-6-6-10-8), mint az egyszerű PT (10-10 alatt) ugyanazon tenyésztési körülmények között, ami arra utal, hogy a HPTT egyedülálló és hatékony. Sőt, felfedeztük, hogy az ECOR törzsek 12 kombinációjából 6, amelyek egy része nem termel plakkképző fágokat (Shibata és mtsai, 2014b), DNáz-érzékeny géntranszfert mutat, ami arra gyanakszik, hogy a HPTT meglehetősen gyakori a természetes E. coli törzsek. Összességében ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy néhány fág- és konjugációmentes transzformációs mechanizmus (ok) természetesen léteznek egyes E. coli törzsekben, és hogy az antibiotikumokkal szemben rezisztens természetes plazmidok (például az ECOR24 törzs plazmidjai: AB905284 és AB905285) útvonal lehet a multirezisztens természetes E. coli sejtek előállításához.

A PT és a HPTT lehetséges mechanizmusai és megvalósíthatósága E. coliban a környezetben

Példák a PT A fagy – olvadás okozta és alacsony frekvenciájú HPTT, amelyet ebben a mini-áttekintésben vezettek be, valószínűleg inkább a pórusképző mechanizmushoz kapcsolódnak, mint a kompetencia génfüggő mechanizmushoz, mivel az ételek és a természetes vizek gyakran tartalmaznak mM Ca2 + és Mg2 + ionokat (Baur et al., 1996, Bauer és mtsai, 1999; Maeda és mtsai, 2003), és a biofilm környezet az élő sejteket az elhalt sejtek tartalmával látja el, beleértve a kétértékű fémionokat és a transzformálható plazmid DNS-t. Amint azt korábban leírtuk (Maeda et al., 2006), egy SA biofilm (átmérője, 10–12 mm; vastagsága, 0,5–0,8 mm) körülbelül 2–5 × 109 sejtet tartalmaz. Emellett az emlősök bélbaktériumai általában körülbelül 1011 sejt / g mennyiséget tartalmaznak (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Figyelembe véve a környezet óriási méretét, még a 10−9−10−10 transzformációs frekvenciákat sem lehet lebecsülni, mivel hatással lesznek a baktériumok populációjára.

A cikkben ismertetett nagyfrekvenciás HPTT magában foglalhatja nemcsak a pórusképző mechanizmus, hanem a kompetencia gén egy része és esetleg egy másik ismeretlen mechanizmus is működik, amint azt fentebb említettük. Mivel a bakteriofágok a bioszféra egyik legelterjedtebb organizmusa, és a környezetben mindenütt jelen vannak (Clokie et al., 2011), a fágok által kiváltott HPTT-t a környezetben is megvalósíthatónak tekintik, valamint a közönséges transzdukciót és más fágból származó a HGT módszerei, pl. géntranszfer ágensek (Lang et al., 2012).

Következtetés és perspektíva

Összességében eredményeink és a kapcsolódó korábbi adatok azt mutatják, hogy több mechanizmus indukálja a transzformációt típusú HGT E. coliban, különféle környezeti és sejtes körülmények, például a táptalaj jellege (pl. víz és étel), a nulla feletti és ~ 40 ° C közötti hőmérséklet, a sejtsűrűség biofilmekben és a különböző genetikai háttér alapján az érintett törzsek közül. Alul lehet becsülni a transzformáció típusú HGT hozzájárulását a környezet genetikai dinamikájához (Bushman, 2002; Thomas és Nielsen, 2005), és tanulmányaink szerint a HPTT E.A coli jelentős átviteli frekvenciákon (10−5−10−10) fordul elő olyan körülmények között, amelyekkel a környezetben megvalósíthatóan találkozhatunk. Ezért a transzformációs típusú HGT hozzájárulhat az antibiotikum-rezisztencia gének elterjedéséhez és a multirezisztens baktériumok megjelenéséhez a laboratóriumon kívüli valós környezetben. További vizsgálatokra van szükség a transzformáció típusú HGT pontos szerepének és hozzájárulásának megértéséhez az antibiotikum-rezisztencia terjesztésében.

Szerzői hozzájárulás

HH, ES és SM írták a cikket.

Finanszírozás

Ezt a munkát JSPS KAKENHI (Grant # 25292051) támogatta.

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában, amelyeket potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetünk. szerkesztési és lektorálási szolgáltatások.