Metodo sperimentale

Proprio come la formula usata per calcolare il rapporto segnale / rumore può avere un effetto drammatico sul la sensibilità apparente di qualsiasi particolare set di dati spettrali, la configurazione hardware dello strumento ei parametri sperimentali dell’acquisizione dei dati, hanno anche un effetto drammatico sulla qualità dello spettro acquisito.

Ci sono molti parametri hardware, impostazioni e opzioni che hanno tutte un effetto sulla sensibilità misurata di uno spettrofluorometro. Ciò può rendere estremamente difficile confrontare in modo assoluto la sensibilità relativa di due strumenti diversi, se non vengono utilizzati in modo praticamente identico. Di seguito discutiamo ciascuno di questi fattori e l’impatto che hanno sui dati risultanti.

Applicabile a tutti i fluorometri a scansione

Lunghezza d’onda di eccitazione: la lunghezza d’onda di eccitazione deve essere identica per tutti i sistemi confrontati. Il metodo HORIBA utilizza un’eccitazione di 350 nm per la banda dell’acqua Raman, come la maggior parte degli altri produttori. Quando eccita a 350 nm, la banda di emissione Raman per l’acqua ha un picco a 397 nm.

È una fortuna che la maggior parte dei produttori si sia standardizzata su questa lunghezza d’onda di eccitazione, in quanto consente un migliore confronto. Tuttavia, è perfettamente valido spostare la lunghezza d’onda di eccitazione su qualsiasi altro valore come un modo per testare la sensibilità in un intervallo di lunghezze d’onda diverso (ad esempio il NIR).

Intervallo di scansione delle emissioni: il metodo HORIBA scansiona il monocromatore di emissione da 365 a 450 nm, con incrementi di 0,5 nm, in modo da raccogliere l’intero picco Raman a 397 nm e anche lo sfondo a 450 nm.

Larghezza di banda (dimensione fenditura): Il metodo HORIBA utilizza il passa banda a 5 nm fenditure sia sullo spettrometro di eccitazione che su quello di emissione. Alcuni produttori specificano fenditure da 10 nm che hanno l’effetto di aumentare la sensibilità rispetto a 5 nm. È stato riportato che il raddoppio della dimensione fisica della fenditura all’ingresso e all’uscita di un monocromatore può quadruplicare l’intensità dell’eccitazione e il throughput di rilevamento delle emissioni poiché il throughput corrisponde al quadrato dell’aumento delle dimensioni, ma questa è una stima semplicistica che dovrebbe essere misurata empiricamente. HORIBA ha misurato la differenza di fattore con HORIBA Fluoromax e ha osservato che per Fluoromax, raddoppiando la dimensione delle fenditure da 5 a 10 nm aumenta il rapporto segnale / rumore complessivo per la banda Raman dell’acqua di oltre 3 volte. Tuttavia, questo sarà diverso per tutti i fluorometri, quindi assicurati di non confrontare con passabanda identici.

Tempo di integrazione (o tempo di risposta): si riferisce a quanto tempo è consentito al rivelatore di raccogliere un segnale in un dato posizione del passo di lunghezza d’onda. Svolge anche un ruolo significativo nella sensibilità complessiva misurata per un fluorometro. Il metodo HORIBA utilizza un tempo di integrazione di 1 secondo in ogni punto della lunghezza d’onda, simile ad altri produttori. Tuttavia, alcuni produttori specificano un tempo di risposta di 2 secondi che aumenta il rapporto segnale / rumore complessivo di quasi un fattore due. Assicurati di utilizzare lo stesso tempo di integrazione (risposta) durante il confronto.

Tipo PMT: la maggior parte degli spettrofluorometri utilizza un tubo fotomoltiplicatore (PMT) come unico rilevatore di emissione di fluorescenza, senza alcuna opzione per cambiare l’alloggiamento del rivelatore. Questo è vero per la maggior parte dei fluorometri analitici da banco. Alcuni di questi sistemi da banco consentono la selezione di diversi PMT individuali con diversi intervalli di lunghezza d’onda e specifiche. I PMT che non rilevano nella NIR tanto quanto gli altri PMT avranno un conteggio delle scure inferiore, in modo che forniscano un migliore rapporto segnale / rumore nell’intervallo da 350 a 400 nm, tuttavia potrebbero non essere utilizzabili nell’intera lunghezza d’onda di emissione gamma desiderata per un particolare laboratorio. Il PMT standard di HORIBA utilizzato nelle serie di fluorometri FluoroMax Plus, Fluorolog3 e QuantaMaster 8000, è Hamamatsu R928P PMT, considerato lo standard industriale per la fluorometria. In questi casi, assicurarsi che ogni fluorimetro utilizzi lo stesso PMT, ove possibile.

Filtri ottici: un filtro ottico può essere aggiunto al percorso ottico di un fluorometro, sia sul lato di eccitazione che sul lato di emissione del campione. Questi possono essere posizionati manualmente in un portafiltri all’interno del compartimento del campione, oppure possono essere parte di una ruota portafiltri che può posizionare automaticamente diversi filtri nel percorso ottico quando vengono selezionati diversi protocolli sperimentali. I filtri ottici hanno l’effetto di migliorare la reiezione della luce parassita a determinate lunghezze d’onda e possono migliorare notevolmente il rapporto segnale / rumore di un fluorimetro. HORIBA non utilizza filtri ottici, diversi dagli spettrometri di scansione stessi, quando specifica l’SNR per acqua Raman con le specifiche della serie Fluoromax, Fluorolog3 o QuantaMaster 8000.Quando si confronta un fluorometro HORIBA con un fluorometro che utilizza filtri automatici, non utilizzare un filtro o, se è automatico, confermare la marca e il tipo di filtri utilizzati e dove vengono utilizzati per replicare un metodo sperimentale simile con un fluorometro HORIBA.

Applicabile ai fluorometri modulari per la ricerca

Tipo di rivelatore: i fluorometri modulari per la ricerca in genere includono un alloggiamento PMT come standard, ma consentono molti tipi diversi di rivelatori a canale singolo per estendere la lunghezza d’onda intervallo o intervallo di durata della fluorescenza di uno strumento. Rivelatori alternativi includono alloggiamenti PMT raffreddati, vari rivelatori a stato solido come InGaAs, MCP PMT e così via. Questi diversi tipi di rilevatori avranno effetti drammatici sul rapporto segnale / rumore di qualsiasi particolare misurazione del campione, quindi anche in questo caso, quando si cerca di confrontare la sensibilità di un fluorimetro con un altro, assicurarsi che lo stesso tipo di rilevatore venga utilizzato per raccogliere dati su entrambi i sistemi.

Temperatura del rivelatore: la maggior parte degli spettrofluorometri commerciali utilizza custodie PMT che non sono raffreddate, e in effetti molti strumenti non offrono nemmeno un’opzione di rivelatore raffreddato. Un alloggiamento PMT raffreddato può migliorare la sensibilità di uno strumento riducendo i conteggi scuri (sfondo) rispetto allo stesso PMT esatto in un alloggiamento ambiente. Gli alloggiamenti PMT standard di HORIBA in FluoroMaxPlus, Fluorolog3 e QuantaMaster 8000 sono alloggiamenti per PMT ambientale, tuttavia le serie Fluorolog3 e QuantaMaster 8000 offrono alloggiamenti PMT raffreddati opzionali per migliorare la sensibilità e il rilevamento NIR. Quando si confrontano i fluorometri di ricerca modulari, assicurarsi di confrontare i dati raccolti con lo stesso tipo di custodia PMT (ambiente o raffreddato) e, se raffreddato, anche raffreddato alla stessa temperatura.

Monocromatore singolo e doppio: modulare i fluorometri da ricerca consentono a un ricercatore di selezionare monocromatici singoli o doppi sul percorso ottico di eccitazione o di emissione. Qui il termine doppio monocromatore si riferisce a due stadi del reticolo dispersivo, uno dopo l’altro, con una fessura di ingresso, una fessura intermedia e una fessura di uscita. Un doppio monocromatore può essere configurato in modalità additiva o dispersiva, ma in entrambi i casi le caratteristiche di rendimento e luce parassita di un monocromatore singolo rispetto a un doppio monocromatore sono molto diverse e avranno un grande impatto sull’SNR di una scansione Raman dell’acqua, anche se le larghezze di banda, i tempi di integrazione e le lunghezze d’onda sono tutti mantenuti costanti.

Densità della scanalatura del reticolo: la densità della scanalatura di un reticolo influenzerà anche il rendimento e quindi la sensibilità di uno spettrofluorometro. Per la maggior parte degli spettrofluorometri questo non è un grosso problema perché i sistemi sono prodotti con un solo reticolo particolare. In questo caso la cosa più importante è assicurarsi che i passa banda siano selezionati in modo che siano gli stessi. Tuttavia, per i fluorometri modulari, è possibile configurare i monocromatori con reticoli diversi o reticoli multipli. Per questi sistemi, devi stare molto attento a mantenere le cose il più simili possibile. Ad esempio, quando si hanno due strumenti con spettrometri di lunghezza focale simili, la modifica della densità della scanalatura del reticolo aumenterà o diminuirà la sensibilità per la stessa impostazione di banda passante a 5 nm. Il metodo HORIBA utilizza reticoli con una densità del boschetto di 1.200 scanalature per millimetro.

Angolo del reticolo del blaze: i reticoli selezionati per un monocromatore di eccitazione o emissione forniscono un rendimento ottimale a una particolare banda di lunghezze d’onda, denominata blaze angolo poiché questo è determinato dall’angolo di incisione del reticolo impartito sulla superficie del reticolo. In quanto tale, un monocromatore ad eccitazione con un monocromatore ad eccitazione blazed da 350 nm e un monocromatore a emissione di 400 nm, sarebbero scelte ottimali per ottenere la migliore sensibilità Raman all’acqua quando eccitato a 350 nm. Poiché la maggior parte dei fluorometri non consente di regolare il reticolo, questa variabile non è un fattore, ma per quelli che consentono di scegliere i reticoli, assicuratevi di scegliere reticoli con lo stesso angolo di fiamma o molto simile per fare un confronto valido .