Introduzione

Il trasferimento genico orizzontale (HGT) tra cellule batteriche contribuisce all’adattamento batterico a vari ambienti e, a lungo termine, all’evoluzione batterica (Lorenz e Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas e Nielsen, 2005). Tuttavia, negli ambienti umani, provoca una diffusione indesiderata di patogenicità, resistenza agli antibiotici o geni artificialmente modificati (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Tre meccanismi di HGT nei batteri sono generalmente accettati: coniugazione, trasduzione e trasformazione (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). La coniugazione e la trasduzione coinvolgono un’apparecchiatura specifica per il trasferimento del DNA dal donatore alle cellule riceventi; questi sono pili coniugativi e virioni fagici, rispettivamente. La trasformazione è principalmente una funzione delle cellule riceventi che esprimono la capacità di assorbire il DNA nudo extracellulare.

La competenza di trasformazione può essere indotta naturalmente o artificialmente, ma non tutte le specie batteriche sviluppano una competenza naturale (Lorenz e Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). Nei batteri trasformabili naturalmente, la competenza è solitamente transitoria e indotta da alterazioni nello stato di crescita dell’organismo (Johnston et al., 2014). È stato identificato un gruppo di “geni della competenza” e sono stati proposti modelli meccanicistici generali (Chen e Dubnau, 2004), sebbene i meccanismi precisi per le singole specie batteriche non siano stati sufficientemente chiariti (Cameron e Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz e Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska e Gerdes, 2015). Poiché la trasformazione richiede DNA nudo extracellulare come substrato, la sensibilità alla DNasi, che degrada il DNA nudo, è la chiave per distinguere la trasformazione dagli altri Meccanismi HGT resistenti alla DNasi (Lorenz e Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa e Berenguer, 2015).

In generale, Si ritiene che l’Escherichia coli non sia trasformabile naturalmente; sviluppa un’elevata competenza genetica solo in condizioni artificiali, inclusa l’esposizione a concentrazioni elevate di Ca2 + e shock termici (Mandel e Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), glicole polietilenico trattare ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989) o scosse elettriche (Sambrook e Russell, 2006). Tuttavia, secondo quanto riferito, E. coli può esprimere una competenza modesta in determinate condizioni che sono fattibili nei suoi ambienti naturali (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . Di seguito, definiamo la trasformazione in cui il plasmide è stato aggiunto esternamente come trasformazione plasmidica (PT) e trasformazione in cui il DNA plasmidico proviene da cellule batteriche morte (dall’ambiente) come trasferimento plasmidico orizzontale per trasformazione (HPTT).

Escherichia coli sembra possedere molteplici meccanismi di assorbimento del DNA, inclusi due popolari: uno che dipende dai “geni della competenza”, che comunemente funzionano in molti batteri gram-negativi e positivi (Finkel e Kolter, 2001; Palchevskiy e Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha e Redfield, 2012; Seitz e Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska e Gerdes, 2015). Questo meccanismo è principalmente condotto dallo specifico apparato molecolare formato attorno alla superficie cellulare struttura, che passa attraverso le membrane cellulari solo DNA lineare a filamento singolo prodotto utilizzando una specifica nucleasi periplasmatica. In E. coli, questi geni non sono considerati contribuenti al PT perché il PT richiede l’assorbimento di double-s intatti DNA circolare tranded (Sinha e Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Pertanto, è improbabile che questo meccanismo contribuisca al PT nell’ambiente. Il secondo meccanismo è quello dipendente da fattori ambientali esterni, come ioni metallici bivalenti, shock termico e stress fisici (Mandel e Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Si ritiene comunemente che questi stimoli inducano la formazione di strutture simili a pori nella superficie cellulare per il passaggio di DNA intatto a doppia elica, compresi i plasmidi circolari, sebbene i dettagli rimangano poco chiari (Reusch et al., 1986; Reusch e Sadoff, 1988; Huang e Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Gli ioni Ca2 + e Mg2 + sono i fattori che inducono la competenza più tipici. Gli habitat ambientali contengono spesso diversi millimolari di questi ioni, le cui concentrazioni sono sufficienti per indurre una competenza debole ma rilevabile in E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Pertanto, questo meccanismo è possibile nell’ambiente al di fuori dei laboratori. Oltre ai due meccanismi di cui sopra, un altro meccanismo è stato proposto da Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) e Sun (2016), in cui sono coinvolti un trasportatore ABC e specifiche proteine periplasmatiche e della membrana interna. Questo meccanismo è regolato da regolatori trascrizionali interni, RpoS e CRP, pertanto è stato suggerito che questo meccanismo è anche un processo naturale geneticamente controllato.

In questa mini recensione, riassumiamo i nostri studi su HGT utilizzando E. coli sistemi sperimentali e discutere il possibile verificarsi di trasformazioni da parte di più meccanismi in ambienti naturali e il suo possibile impatto sulla diffusione di geni di resistenza agli antibiotici.

Trasformazione plasmidica di E. coli in condizioni che imitano l’ambiente naturale

PT negli estratti alimentari

I cibi umani sono eccellenti terreni di coltura per molti batteri. Tuttavia, poca attenzione è stata prestata agli effetti degli alimenti sulla fisiologia batterica oltre alla crescita e alla sopravvivenza. Abbiamo studiato la possibilità che gli alimenti agiscano da media per la trasformazione batterica. Gli alimenti contengono spesso concentrazioni millimolari di ioni metallici bivalenti (Ca2 + e Mg2 +) e sono spesso conservati in frigorifero o congelatore seguiti da un riscaldamento rapido (cioè shock termico). Queste condizioni favoriscono lo sviluppo della competenza in E. coli (Mandel e Higa, 1970; Huang e Reusch, 1995; Baur et al., 1996); poiché E. coli è un comune contaminante alimentare, è interessante determinare se può essere trasformato in alimenti. Certi alimenti possono infatti agire come mezzi che inducono competenza in E. coli (Maeda et al., 2003). Su 42 campioni di cibo testati, > 10 hanno mostrato la capacità di indurre la competenza a una frequenza di 10−7-10−9. Tra questi, il surnatante del tofu (un alimento simile al formaggio fatto di latte di soia cagliato) ha mostrato la più alta attività (una in 10-7-10-8 cellule riceventi), corrispondente a circa la metà dell’efficienza ottenuta con 100 mM CaCl2. Tuttavia, non c’erano chiare correlazioni tra le frequenze di trasformazione e le caratteristiche chimiche degli alimenti (concentrazioni di Ca2 + o Mg2 + e pH), suggerendo che fattori complessi all’interno degli alimenti influenzano lo sviluppo delle competenze. Effetti simili degli alimenti nell’indurre la trasformazione sono stati riportati in E. coli (Bauer et al., 1999) e Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT in Biofilm Solid-Air

Molti batteri esistono come biofilm in ambienti naturali e artificiali (Davey e O’Toole, 2000). I biofilm sono aggregati di microbi che si formano alle interfacce solido-liquido o solido-aria (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Le cellule in queste colture ad alta densità interagiscono tra loro ed esprimono funzioni fisiologiche distintive rispetto alle loro forme planctoniche libere. Precedenti studi sulla trasformazione di E. coli si sono concentrati esclusivamente su cellule planctoniche (Mandel e Higa, 1970; Hanahan, 1983), ma abbiamo dimostrato che le cellule di E. coli all’interno di biofilm SA sviluppano competenza a una frequenza di 10-6-10-8 su vari terreni solidi, inclusi agar LB e H2O e vari cibi umidi (Maeda et al., 2004). Le cellule viventi generalmente coesistono con le cellule morte nei biofilm e questi ultimi possono rilasciare il loro DNA e alcuni ioni metallici bivalenti, inclusi Ca2 + e Mn2 +, nel microambiente locale del biofilm (Davey e O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Queste condizioni possono favorire lo sviluppo della trasformazione e potrebbero non essere esclusive dei biofilm SA poiché è stato segnalato anche un miglioramento simile nei biofilm aria-liquido di E. coli (Król et al., 2011).

PT dei ceppi di E. coli selvatici in acqua

I nostri risultati e quelli di altri suggeriscono che l’E. Coli ambientale può potenzialmente acquisire DNA estraneo tramite trasformazione. Tuttavia, ci sono pochi precedenti rapporti di indagini sulla trasformabilità dei ceppi naturali di E. coli (Woegerbauer et al., 2002; Sinha e Redfield, 2012). Pertanto, abbiamo esaminato il potenziale dei ceppi naturali di E. coli di sviluppare competenze in condizioni ambientali. Abbiamo utilizzato una raccolta standard di ceppi di riferimento di E. coli (ECOR) come modello di E. coli naturale (Ochman e Selander, 1984) perché questi ceppi ECOR sono stati ampiamente utilizzati in vari studi sulla fisiologia, il comportamento e la variazione genotipica di E. coli naturale (Tenaillon et al., 2010). Abbiamo scoperto che alcuni ceppi ECOR hanno mostrato trasformabilità rilevabile (10-10-10-11) in acqua naturale (acqua pura naturale in bottiglia disponibile in commercio) a temperature costanti e variabili tra 5 e 35 ° C ea temperature invernali in un esperimento sul campo, suggerendo che l’E. coli naturale può potenzialmente sviluppare competenze in determinate condizioni che potrebbero verificarsi nell’ambiente (Matsumoto et al., 2016b).

Trasferimento orizzontale di plasmidi mediante trasformazione in E. coli

HPTT indotto da congelamento-scongelamento in acque naturali ed estratti alimentari

Nell’ambiente, il DNA nudo può essere fornito naturalmente dalle cellule morte alle cellule vicine all’interno dello stesso habitat o microambiente.Pertanto, vale la pena indagare la possibilità di HPTT in un sistema chiuso in alcune condizioni possibili. Il congelamento-scongelamento è un processo comune nella manipolazione degli alimenti e si verifica anche in natura. Il trattamento con congelamento-scongelamento delle cellule di E. coli può favorire la fuoriuscita di DNA dalle cellule morte e il successivo assorbimento da parte delle cellule sopravvissute perché rispondono allo shock termico, con conseguente trasformazione in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Questo trattamento di sospensioni condensate di ceppi misti di E. coli in acque naturali ed estratti alimentari ha causato il trasferimento laterale in situ di plasmidi non coniugativi con una frequenza di 10-8-10-10 (Ishimoto et al., 2008). Questo fenomeno si è verificato anche dopo 1-2 mesi di conservazione a −20 ° C e la sua sensibilità alla DNasi ha dimostrato che era mediata tramite un meccanismo di trasformazione.

Bassa frequenza di HPTT nei biofilm SA

Si ritiene che i biofilm siano ambienti adatti per la trasformazione in situ perché le cellule viventi e morte coesistono in stretta vicinanza e il DNA rilasciato dalle cellule morte spesso si accumula attorno alle cellule viventi. Inoltre, come descritto sopra, poiché le cellule di E. coli possono sviluppare una competenza modesta nei biofilm SA (Maeda et al., 2004), entrambi questi fattori contribuiscono all’HPTT nei biofilm. Semplicemente co-coltivando un ceppo privo di plasmidi con uno che ospita un plasmide non coniugativo in un biofilm SA su terreno agar privo di antibiotici, le cellule trasformate sono state prodotte a bassa frequenza (10-9-10-10) entro 24-48 h (Maeda et al., 2006). Le colture liquide degli stessi ceppi nel brodo LB non hanno prodotto o pochi trasformanti, suggerendo l’importanza della formazione di biofilm di SA per il trasferimento di plasmidi. In sostanza, lo stesso fenomeno si è verificato nei biofilm di SA su supporti a base di alimenti (Ando et al., 2009). Questo fenomeno si è verificato anche tra ceppi di laboratorio popolari come DH5, HB101 e MG1655 (Etchuuya et al., 2011), che sono privi di fago lisogenico e senza apparato coniugativo, suggerendo che la bassa frequenza di trasferimento plasmidico orizzontale nei biofilm SA può avvengono senza l’ausilio del fago o del macchinario di coniugazione e, quindi, che questo trasferimento di DNA è dovuto a una sorta di trasformazione. Tuttavia, poiché la mutazione rpoS- non ha influenzato questo HPTT (Maeda et al., 2006), è improbabile che sia coinvolto il meccanismo RpoS-dipendente (Zhang et al., 2012).

Alta frequenza di HPTT Indotto da P1 Phage

Valutando combinazioni di diversi ceppi e plasmidi per il trasferimento plasmidico orizzontale, si è scoperto che il ceppo di E. coli CAG18439 agisce sia come donatore di plasmide che come ricevente di plasmide in combinazione con il plasmide pHSG299 e potrebbe trasferire frequentemente il plasmide in una coltura cellulare mista anche in un mezzo liquido (Etchuuya et al., 2011). È stato dimostrato che questo HGT è un tipo di trasformazione perché il trasferimento plasmidico ad alta frequenza (10-5-10-8) era sensibile alla DNasi. Ulteriori studi hanno rivelato che questo fenomeno presenta alcune caratteristiche specifiche: (1) promozione da parte del fattore proteico rilasciato da CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) promozione mediante una sequenza di 88 bp su pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) alta frequenza di trasferimento (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); e (4) dipendenza da geni specifici (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Rispetto a (1), uno studio successivo ha rivelato che questi fattori proteici includono una particella fagica P1vir (o un suo derivato) e che il fago P1vir aggiunto esternamente può riprodurre il trasferimento plasmidico orizzontale tra le cellule di E. coli e le altre tre caratteristiche principali di CAG18439 -HPTT dipendente (Sugiura et al., 2017). Questo fenomeno era anche ampiamente sensibile alla DNasi, suggerendo che gran parte di questo trasferimento plasmidico è dovuto alla trasformazione nonostante il coinvolgimento del fago P1. Il meccanismo di trasformazione del trasferimento plasmidico indotto dal fago P1vir può essere dovuto all’infezione del fago o al risveglio spontaneo del fago lisogenizzato nelle cellule che ospitano plasmidi, portando alla lisi cellulare e al successivo rilascio di DNA plasmidico intracellulare in una forma utilizzabile per la trasformazione. Sebbene un tale meccanismo sia generalmente fattibile, ci sono state poche chiare dimostrazioni di esso in E. coli. Un recente studio di Keen et al. (2017) utilizzando un altro sistema fagico ha anche dimostrato un meccanismo di trasformazione indotto da fago simile in E. coli. Tuttavia, l’HPTT di P1vir o CAG18439 non può essere adeguatamente spiegato solo dall’aumentato apporto di DNA dalla lisi cellulare indotta da fago e differisce dalla semplice trasformazione in E. coli (Hanahan, 1983) in termini di caratteristiche distintive (2-4). Rispetto a (2), la sequenza di 88 bp su pHSG299 non è omologa alla parte della sequenza del genoma del fago P1. Questa sequenza si trova spesso nei database tra le sequenze vettoriali di clonazione generale, ma non in alcuna fonte naturale. Tracciando il processo di costruzione di pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), tuttavia, sospettiamo che la sequenza di 88 bp provenga da R6-5, a plasmide R coniugativo.Questa sequenza e elementi di DNA simili possono contribuire a HPTT di R e altri plasmidi nell’ambiente. Rispetto a (3), questo trasferimento ad alta frequenza non può essere spiegato dalla semplice capacità di PT di CAG18439 e di altri ceppi utilizzati perché il PT semplice in quei ceppi sotto la condizione di coltura equivalente era 105-102 volte meno frequente (Etchuuya et al., 2011). È stato, quindi, suggerito che un fattore proteico derivato da CAG18439, con dimensioni stimate tra 9 e 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) potrebbe anche essere coinvolto nella promozione dell’HPTT. Questo fattore presumibilmente aiuta nell’assorbimento del DNA da parte delle cellule riceventi, probabilmente in combinazione con la sequenza di 88 bp sul DNA in trasformazione. Infine, rispetto a (4), studi successivi di screening a livello di genoma per geni riceventi coinvolti in HPTT hanno suggerito che più geni partecipino al meccanismo (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Questi includono quelli che non sono stati segnalati per essere coinvolti nella trasformazione naturale o artificiale in E. coli (come rodZ) e alcuni omologhi noti di geni di competenza, come ybaV e yhiR (Finkel e Kolter, 2001; Palchevskiy e Finkel, 2006 ), ma non includono rpoS e altri geni correlati al meccanismo dipendente da RpoS (Zhang et al., 2012). Nel complesso, questi risultati indicano un meccanismo sconosciuto e complesso di HPTT ad alta frequenza indotto da fago che può in parte condividere il percorso della trasformazione naturale.

HPTT tra ceppi naturali di E. coli

Per valutare ulteriormente la generalità e la varietà di HPTT nei ceppi di E. coli, in uno studio sull’HPTT sono stati utilizzati ceppi naturali (i suddetti ceppi ECOR). Diverse combinazioni di ceppi ECOR sono state co-coltivate in terreni liquidi, con conseguente trasferimento orizzontale DNasi-sensibile di geni naturali di resistenza agli antibiotici (Matsumoto et al., 2016a, b). L’isolamento dei plasmidi da questi nuovi trasformanti ha dimostrato il trasferimento plasmidico orizzontale tra i ceppi ECOR (Matsumoto et al., 2016a, b). Semplici esperimenti di PT utilizzando gli stessi ceppi ECOR hanno rivelato che HPTT si verifica molto più frequentemente (10-6-10-8) rispetto al semplice PT (inferiore a 10-10) nelle stesse condizioni di coltura, il che ha suggerito che HPTT è unico ed efficace. Inoltre, abbiamo scoperto che 6 delle 12 combinazioni dei ceppi ECOR, alcune delle quali non producono batteriofagi che formano placche (Shibata et al., 2014b), mostravano un trasferimento genico sensibile alla DNasi, inducendoci a sospettare che l’HPTT sia piuttosto comune nei Ceppi di E. coli. Nel complesso, questi dati suggeriscono che alcuni meccanismi di trasformazione liberi da fago e coniugazione esistono naturalmente anche in alcuni ceppi di E. coli e che l’HPTT di plasmidi naturali resistenti agli antibiotici (come i plasmidi del ceppo ECOR24: n. Di adesione AB905284 e AB905285) può essere un percorso per la produzione di cellule di E. coli naturali multiresistenti.

Possibili meccanismi e fattibilità di PT e HPTT in E. coli nell’ambiente

Esempi di PT e L’HPTT indotto da congelamento-scongelamento e a bassa frequenza introdotto in questa mini-revisione è probabilmente più correlato al meccanismo di formazione dei pori rispetto al meccanismo dipendente dal gene della competenza perché gli alimenti e le acque naturali spesso contengono livelli di mM di ioni Ca2 + e Mg2 + (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003) e l’ambiente del biofilm forniscono alle cellule viventi il contenuto di cellule morte, inclusi ioni metallici bivalenti e DNA plasmidico trasformabile. Come abbiamo descritto in precedenza (Maeda et al., 2006), un biofilm SA (diametro, 10–12 mm; spessore, 0,5–0,8 mm) contiene circa 2-5 × 109 cellule. Inoltre, i batteri intestinali nei mammiferi ammontano generalmente a circa 1011 cellule / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Considerando l’enorme scala dell’ambiente, anche le frequenze di trasformazione di 10-9-10-10 non possono essere sottovalutate poiché avranno un impatto sulle popolazioni di batteri.

L’HPTT ad alta frequenza descritto in questo articolo può coinvolgere non solo il meccanismo di formazione dei pori, ma anche una parte delle funzioni del gene della competenza e forse un altro meccanismo sconosciuto, come menzionato sopra. Poiché i batteriofagi sono uno degli organismi più abbondanti nella biosfera e ubiquitari nell’ambiente (Clokie et al., 2011), anche l’HPTT indotto da fago è considerato fattibile nell’ambiente, così come la normale trasduzione e altri derivati dai fagi modi di HGT, ad esempio, agenti di trasferimento genico (Lang et al., 2012).

Conclusione e prospettiva

Nel complesso, i nostri risultati e i dati precedenti correlati indicano che più meccanismi inducono la trasformazione- tipo HGT in E. coli in base a varie circostanze ambientali e cellulari come la natura del mezzo (ad esempio, acqua e cibo), temperatura variabile da sotto zero a ∼40 ° C, alta densità cellulare nei biofilm e background genetico variabile dei ceppi coinvolti. Il contributo dell’HGT di tipo di trasformazione alle dinamiche genetiche nell’ambiente può essere sottostimato (Bushman, 2002; Thomas e Nielsen, 2005), ei nostri studi indicano che l’HPTT in E.coli si verifica a frequenze di trasferimento sostanziali (10-5-10-10) nelle condizioni che possono essere riscontrate nell’ambiente. Pertanto, l’HGT di tipo trasformazione può contribuire alla diffusione di geni di resistenza agli antibiotici e all’emergenza di batteri multiresistenti nell’ambiente reale al di fuori dei laboratori. Sono necessari ulteriori studi per comprendere il ruolo preciso e il contributo dell’HGT di tipo trasformazione nella diffusione della resistenza agli antibiotici.

Contributi dell’autore

HH, ES e SM hanno scritto l’articolo.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto da JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotte in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Siamo grati a Enago (www.enago.jp) per l’inglese servizi di editing e correzione di bozze.