Abstract

TP53, che codifica per p53, è uno dei più famosi geni oncosoppressori. La maggior parte dei tumori umani dimostra l’inattivazione della via p53. Il mutante p53 non solo non funziona più come soppressore del tumore, ma può anche esercitare effetti di promozione del tumore. La funzione di base di p53 è rispondere allo stress cellulare. Esaminiamo qui i recenti progressi nella ricerca su p53 e ci concentriamo su apoptosi, arresto del ciclo cellulare e senescenza in risposta allo stress. Esaminiamo anche le applicazioni cliniche della terapia basata su p53 per il cancro umano.

1. Introduzione

Il gene TP53, che codifica per p53, è uno dei geni più frequentemente mutati nei tumori umani. È stato riferito che circa la metà di tutti i tumori ha inattivato p53. La proteina p53 ha un’ampia gamma di funzioni biologiche, inclusa la regolazione del ciclo cellulare, l’apoptosi, la senescenza, il metabolismo del DNA, l’angiogenesi, la differenziazione cellulare e la risposta immunitaria. Numerose pubblicazioni hanno riportato varie funzioni di p53, inclusi ruoli trascrizionali, post-trascrizionali e post-traduzionali.

In questo documento, ci concentreremo su questioni riguardanti p53 e l’applicazione di terapie antitumorali basate su p53. Come esaminato da Vousden e Prives, le funzioni principali di p53 sono la regolazione dell’arresto della crescita e dell’apoptosi.

2. Funzioni normali di p53

Numerosi studi hanno dimostrato che p53 è un fattore di trascrizione che prende di mira molti geni e microRNA in risposta allo stress della cantina. Il ruolo chiave di p53 come soppressore del tumore è bloccare la progressione del ciclo cellulare e / o indurre l’apoptosi, in risposta a stress cellulari come il danno al DNA. La ridotta attività di p53 promuove l’accumulo di danni al DNA nelle cellule, che porta a un fenotipo del cancro. Come fattore di trascrizione, p53 forma una rete di regolazione genica diversificata e complessa. Sono state condotte indagini approfondite per chiarire le sequenze target che p53 riconosce, l’elemento di risposta p53 (RE), come recentemente rivisto da Riley et al. p53 ha una gamma molto ampia di attività biologiche, quindi questa revisione si concentrerà sul ruolo di p53 come soppressore del tumore e sulle sue implicazioni per la terapia del cancro.

2.1. Tumori umani e mutazioni p53

La frequenza della mutazione TP53 varia da ~ 10% (tumori ematopoietici) al 50-70% (tumori ovarici, colorettali e della testa e del collo). La mutazione germinale di TP53 causa la sindrome di Li-Fraumeni, che è una sindrome da cancro familiare che include cancro al seno, sarcoma dei tessuti molli e vari altri tipi di cancro. La maggior parte delle mutazioni di TP53 nei tumori umani provocano mutazioni all’interno del dominio di legame al DNA, impedendo così a p53 di trascrivere i suoi geni bersaglio. Tuttavia, il mutante p53 non solo ha portato a una perdita della normale funzione della proteina wild-type, ma ha anche portato a nuove capacità di promuovere il cancro. Il primo rapporto di questo guadagno di funzione da parte del mutante p53 è stata l’osservazione che la trasfezione del mutante p53 in cellule p53-null aumenta la formazione di tumori nei topi. Numerosi studi successivi hanno confermato questo risultato.

2.2. p53 come soppressore del tumore

2.2.1. p53 come sensore di danni al DNA

L’instabilità genetica è una delle caratteristiche più importanti dei tumori maligni. Esistono sistemi molto sofisticati per rilevare i danni al DNA e riparare il genoma. p53 gioca un ruolo importante in tali sistemi “custodi”. Quando p53 risponde al danno al DNA, provoca l’arresto del ciclo cellulare o l’apoptosi.

Nel 1991 è stato dimostrato che l’induzione di p53 wild-type può indurre apoptosi nelle cellule leucemiche. I topi che hanno uno specifico mutante p53 non hanno la capacità di indurre l’arresto del ciclo cellulare, ma mantengono la capacità di indurre l’apoptosi, consentendo loro di sopprimere efficacemente i tumori indotti da oncogene, suggerendo così che la funzione proapoptotica di p53 può svolgere un ruolo maggiore ruolo importante nei suoi effetti antitumorali che nell’induzione dell’arresto del ciclo cellulare.

2.2.2. p53 e apoptosi

Numerosi rapporti hanno descritto il meccanismo con cui p53 induce l’apoptosi. Come p53 funziona principalmente come fattore di trascrizione, è importante esplorare i geni regolati da p53 che contribuiscono alla regolazione dell’apoptosi.I primi studi hanno dimostrato che il p53 wild-type può legare la regione del promotore del gene bax e regolare la trascrizione del gene bax. bax è un membro della Bc famiglia l-2, che forma eterodimeri con Bcl-2, inibendone l’attività. La famiglia delle proteine Bcl-2 gioca un ruolo importante nell’apoptosi e nel cancro. Ad esempio, Bcl-2 controlla il rilascio del citocromo c dai mitocondri, che attiva la via apoptotica attivando la caspasi 9. La caspasi 9 quindi attiva la caspasi 3. Entrambe le caspasi svolgono un ruolo chiave nella via apoptotica.

Diversi tumori umani, tra cui il cancro al colon e allo stomaco, hanno alterato l’espressione di Bcl-2. Tuttavia, l’importanza del livello di espressione di Bcl-2 sulla prognosi dei malati di cancro è ancora oggetto di studio.Anche il contributo dell’espressione di bax alla prognosi dei malati di cancro e alla risposta alla terapia non è chiaro. Nel cancro al seno, uno studio ha dimostrato che un basso livello di espressione di bax è associato a una prognosi sfavorevole, mentre altri rapporti non hanno mostrato alcuna correlazione tra il livello di espressione di bax e la prognosi. Saranno quindi necessarie ulteriori ricerche.

CD95 (chiamato anche Fas e Apo-1) è un “recettore della morte” che indica il suo ruolo principale nell’apoptosi. Il primo rapporto di CD95 ha mostrato che un anticorpo anti-CD95 ha ridotto la crescita dei tumori xenotrapianti umani a cellule B. Da allora, sono stati pubblicati numerosi rapporti sulla via di segnalazione indotta da CD95 nell’apoptosi. Gli agenti citotossici, come i farmaci chemioterapici, possono indurre l’apoptosi nelle cellule sensibili ai farmaci. È quindi importante chiarire quali vie di segnalazione contribuiscono maggiormente all’apoptosi. Spiegare queste informazioni sarebbe utile per la scoperta di farmaci.

Diversi rapporti hanno indicato che la via del CD95 gioca un ruolo importante nell’apoptosi indotta da agenti citotossici e che questo sistema comporta l’attivazione di p53 wild-type. Pertanto, lo stato di p53 può influenzare la chemiosensibilità tramite la segnalazione CD95. Tuttavia, un recente rapporto ha indicato che CD95 potrebbe promuovere la crescita del tumore. d e dipende da una varietà di fattori.

Esiste una sottofamiglia Bcl-2 che contiene solo il dominio BH3. Sono state identificate diverse proteine solo BH3 e p53 funge da fattore di trascrizione per PUMA e NOXA, che appartengono entrambi a questa classe. PUMA è anche un mediatore chiave della via apoptotica indotta da p53.

Quando PUMA viene interrotto nelle cellule del cancro del colon, l’apoptosi indotta da p53 viene prevenuta. PUMA può svolgere un ruolo fondamentale nella determinazione del destino cellulare (morte cellulare programmata rispetto all’arresto del ciclo cellulare) in risposta all’attivazione di p53. Un rapporto sui topi knockout PUMA ha mostrato che knockout di PUMA ricapitola il deficit apoptotico osservato nei topi knockout p53. PUMA è un mediatore essenziale per l’apoptosi dipendente e indipendente da p53 in vivo. Poiché eludere l’apoptosi è uno dei tratti distintivi del cancro, PUMA può anche svolgere un ruolo importante durante la carcinogenesi.

Recenti rapporti hanno tuttavia dimostrato che in determinate situazioni, l’apoptosi può promuovere la cancerogenesi. Michalak et al. e Labi et al. ha dimostrato che la perdita di linfomagenesi timica indotta da radiazioni gamma PUMA ablata. Le cellule staminali ematopoietiche carenti di PUMA sono protette dalla morte cellulare indotta dai raggi gamma, che riduce la proliferazione e la replicazione compensatorie. D’altra parte, i topi wild-type subiscono una massiccia morte cellulare quando hanno ricevuto l’irradiazione gamma, che successivamente ha portato al ripopolamento della regione da parte delle cellule staminali / progenitrici. Questi rapporti indicano che la struttura staminale / progenitrice dell’omeostasi del tessuto può sopprimere la formazione del tumore. Questo fenomeno dovrà essere confermato, ma dovrebbe essere tenuto presente quando si trattano pazienti con strategie come la chemioterapia e / o le radiazioni.

2.2.3. p53 e arresto del ciclo cellulare

La proteina p53 sopprime la formazione di tumori non solo inducendo l’apoptosi ma anche provocando l’arresto del ciclo cellulare. A seconda del tipo di stress cellulare, p53 può indurre l’arresto G1 attraverso l’attivazione della trascrizione dell’inibitore della chinasi ciclina-dipendente p21. Questo processo è ben noto ed è stato ampiamente studiato. p53 regola anche la transizione G2 / M. Ad esempio, p53 può bloccare l’ingresso delle cellule nella mitosi mediante l’inibizione di Cdc2. Cdc2 deve legarsi alla ciclina B1 per funzionare. La repressione della ciclina B1 da parte di p53 arresta anche le cellule in G2. Tuttavia, il ciclo cellulare transitorio potrebbe non portare all’eradicazione del tumore, perché una cellula con potenziale oncogenico che non può essere riparato può riprendere la proliferazione.

Pertanto, l’altro meccanismo, la senescenza cellulare, può svolgere un ruolo importante nella p53- soppressione del tumore mediata. La senescenza cellulare è l’arresto permanente del ciclo cellulare. Ci sono molti rapporti riguardanti la correlazione tra sviluppo del tumore, p53 e senescenza. Discuteremo alcuni di questi fattori dal punto di vista della terapia del cancro. La ras oncogenica espressa nelle cellule primarie umane e di roditori provoca senescenza cellulare. Questo processo è dovuto all’accumulo di p53 e p16. L’inattivazione di p53 o p16 previene la senescenza indotta da ras. Questo rapporto implica che la senescenza da cantina ha un ruolo importante nel sopprimere lo sviluppo del tumore. L’inattivazione di p53, come è presente nella maggior parte dei tumori umani, consente alle cellule di eludere la senescenza da cantina, determinando così lo sviluppo del tumore a macrolivello.

p53 sembra anche prevenire lo sviluppo di lesioni premaligne in tumori maligni attivando programmi di senescenza . La senescenza cellulare indotta da p53 è importante non solo per la prevenzione del cancro, ma anche per l’effetto antitumorale indotto da qualsiasi p53 wild-type introdotto nei tumori consolidati.

Xue et al. ha costruito un modello murino di cancro al fegato con p53 endogeno regolato condizionatamente.La riattivazione della p53 endogena nei tumori con deficit di p53 determina una regressione completa del tumore. È interessante notare che la risposta primaria a p53 non era l’apoptosi, ma l’induzione di un programma di senescenza in cantina. Questo programma ha innescato una risposta immunitaria innata che ha eliminato il tumore dall’ospite.

Abbiamo esaminato due ruoli importanti di p53 come soppressore del tumore. Tra le varie funzioni della p53, l’apoptosi e la senescenza sono i principali meccanismi responsabili della sua soppressione tumorale. Tuttavia, resta ancora da chiarire esattamente come p53 determini se si verifica l’attivazione del programma di senescenza o del programma di apoptosi. Questa domanda è particolarmente importante per lo sviluppo della terapia del cancro basata su p53, compresi gli approcci in combinazione con la chemioterapia convenzionale. La maggior parte degli agenti chemioterapici convenzionali ottiene l’eliminazione delle cellule tumorali uccidendole. Pertanto, se p53 induce senescenza piuttosto che apoptosi, emergerà un conflitto. Infatti, è stato riportato che alcuni tipi di cancro al seno sono protetti da agenti chemioterapici citotossici da p53 endogeno.

Pertanto, molteplici fattori, come la qualità e la quantità di stress cellulare, il tipo di tessuto e il microambiente della cantina, determina il destino della cellula. Vousden e Prives hanno proposto un modello in cui la decisione tra la vita e la morte può essere determinata dall’entità del danno o dalla durata dello stress. Nel loro modello, un basso livello di stress che può essere riparato provoca una risposta di riparazione / sopravvivenza del DNA, mentre un alto livello di stress che non può essere riparato induce una risposta apoptotica o senescenza. Questa doppia natura di p53, killer e protettore, indica la possibilità che p53 possa anche agire come promotore del tumore. La funzione antiapoptotica di p53 può portare alla sopravvivenza delle cellule danneggiate, il che può aumentare la possibilità di trasformazione maligna (Figura 1).

Figura 1

Vousden e Prives hanno proposto un modello del doppio meccanismo della funzione di p53 nei tumori. Il risultato dell’attivazione di p53 dipende da più variabili. In questo modello, la risposta di p53 a un basso stress provoca l’arresto del ciclo cellulare, l’inibizione della crescita, la riparazione del DNA e così via. Questa risposta consente alle cellule di ripristinare il danno indotto dallo stress cellulare. Ma quando le cellule ricevono uno stress elevato che non può essere ripristinato, la p53 agisce come killer che può indurre apoptosi o senescenza, prevenendo la proliferazione delle cellule difettose. Se p53 risponde erroneamente come un protettore quando le cellule ricevono uno stress elevato che non può essere riparato, le cellule mantengono il danno genetico, che può portare o contribuire alla progressione del cancro (linea tratteggiata).

2.3. Applicazioni della terapia antitumorale basata su p53

Poiché la maggior parte, se non tutti, i tumori umani ospitano una p53 alterata, il concetto di ripristino di p53 per la terapia del cancro è molto attraente. Un modello animale ha mostrato la riattivazione di p53 wild-type per provocare una regressione efficiente del tumore, inclusa la regressione del linfoma e del carcinoma epatico.

2.3.1. Riattivazione del mutante p53

Esiste una classe di piccole molecole che riattiva le funzioni wild-type del mutante p53. PhiKan083 è un derivato del carbazolo trovato dallo screening in silico della struttura cristallina di p53. Legando la p53 mutata, PhiKan083 aumenta la temperatura di fusione della p53 mutata, il che si traduce nella riattivazione della sua funzione. PRIMA-1 è un’altra piccola molecola identificata dallo screening cellulare che ha ripristinato il legame al DNA sequenza-specifica e la conformazione attiva di p53. CP-31398 è anche una piccola molecola in grado di ripristinare il ripiegamento proteico di p53 mutato in una conformazione più naturale che consente una funzione wild-type.

2.3.2. Stabilizzazione di p53

MDM2 è una ubiquitina ligasi E3 che controlla la degradazione di p53. Molti tumori sovraesprimono MDM2, anche i tumori senza mutazioni di p53. Targeting MDM2 per la stabilizzazione di p53 sembra essere promettente, così tanti rapporti sul targeting MDM2 o MDM2-p53 sono stati pubblicati.

Ad esempio, le nutlin sono composti cis-imidazolina che agiscono come antagonisti del MDM2- interazione p53. L’analisi della struttura cristallina ha mostrato che la nutlin si lega nella tasca di MDM2 per prevenire l’interazione p53-MDM2. Nutlin può attivare la via p53, inducendo così le cellule tumorali e i tumori xenotrapianti nei topi a subire l’arresto del ciclo cellulare, l’apoptosi e l’inibizione della crescita.

MI-219 è un’altra piccola molecola che inibisce l’interazione MDM2-p53. MI-219 attiva anche la via p53 nelle cellule con p53 wild-type. Apoptosi e arresto del ciclo cellulare sono stati osservati nei tumori xenotrapianti che hanno provocato la regressione del tumore.

Tuttavia, l’inibizione di MDM2 e l’attivazione di p53 nel tessuto normale possono essere dannose. Ringshausen et al. ha mostrato che p53 si attiva spontaneamente in molti tessuti nei topi con deficit di MDM2.Inoltre, p53 ha innescato patologie fatali che includevano l’ablazione di tessuti classicamente radiosensibili.

2.3.3. Altre classi di farmaci per la stabilizzazione di p53

Tenovin è stato trovato da uno screening farmacologico cellulare per attivare p53. Tenovin agisce come un inibitore delle attività di deacetilazione delle proteine di SirT1 e SirT2. È stato dimostrato che la somministrazione intraperitoneale di tenovin-6 induce una regressione dei tumori xenotrapianti in modalità topo.

Issaeva et al. ha esaminato una libreria chimica e ha trovato la piccola molecola RITA (riattivazione di p53 e induzione dell’apoptosi delle cellule tumorali), che si lega a p53 e inibisce l’interazione p53-MDM2 sia in vitro che in vivo. RITA ha indotto l’apoptosi in varie cellule tumorali che hanno mantenuto il wild type p53. Hanno anche scoperto che la p53 rilasciata da MDM2 da RITA promuove p21 e hnRNP K (un cofattore p53), implicando così che p21 gioca un ruolo importante nella regolazione del destino delle cellule tumorali dopo la riattivazione di p53 (Figura 2).

Figura 2

Strategie per stabilizzazione di p53 e riattivazione del mutante p53.

2.4. Inibizione di p53 per la terapia del cancro

L’inibizione di p53 può proteggere le cellule normali durante la chemioterapia genotossica o la radioterapia. Gli effetti collaterali della terapia genotossica per il cancro sono in gran parte causati dall’apoptosi mediata da p53. La piccola molecola pifithrin-alfa può bloccare l’attività trascrizionale dipendente da p53 e proteggere i topi dagli effetti collaterali letali associati al trattamento antitumorale. Se possiamo evitare lo stress genotossico dose-limitante per le cellule normali durante la chemioterapia o la radioterapia per il cancro, sarà quindi possibile utilizzare una dose più alta per i pazienti che non rispondono sufficientemente alla chemioterapia convenzionale.

2.5. Terapia genica p53

La prima terapia genica basata su p53 è stata segnalata nel 1996. Un vettore retrovirale contenente il gene p53 wild-type sotto il controllo di un promotore di actina è stato iniettato direttamente nei tumori di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule . Dopo lo sviluppo di un virus p53 ricombinante con difetto di replicazione (Ad5CMV-p53), sono stati condotti molti studi clinici, incluso uno su pazienti con cancro esofageo. Alcuni studi hanno raggiunto la fase III, ma l’approvazione finale da parte della FDA non è stata ancora concessa. Recentemente, in Cina si è sviluppata la terapia genica basata su p53.

2.6. Immunoterapia basata su p53

I linfociti T citotossici antigene-specifici associati al tumore possono mediare la risposta immunitaria dell’ospite contro il cancro in vivo. La proteina P53, specialmente mirata alla mutazione missenso di p53, può essere candidata come antigene tumorale. Alcuni malati di cancro hanno anticorpi contro p53, la frequenza e il significato clinico sono ancora in discussione.

Speetjens et al. hanno riportato studi clinici di un vaccino sintetico a peptide lungo (p53-SLP) specifico per p53 per pazienti con cancro colorettale metastatico. Dieci pazienti sono stati vaccinati con p53-SLP in uno studio di fase I e di fase II. La tossicità era tollerabile e la risposta immunitaria specifica per p53 è stata rilevata in 9 pazienti su 10. La reattività dei linfociti T specifici per P53 è persistita per più di 6 mesi in 6 su 9 pazienti. Sebbene lo studio fosse di Fase I / II, il beneficio clinico potrebbe essere difficile da ottenere perché la maggior parte dei pazienti aveva cellule T helper prive di citochine chiave. È stato segnalato lo studio preclinico di fase I / II di INGN-225 (Introgen), un vaccino a cellule dendritiche indotto da adenovirus modificato con p53 per pazienti con carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC). INGN-225 è stato ben tollerato e ha indotto una risposta immunitaria specifica per p53 in 18/43 (41,8%) pazienti e ha sensibilizzato l’SCLC alla successiva chemioterapia.

3. Conclusione

In questo documento, ci siamo concentrati sulle funzioni di p53 e sulle applicazioni cliniche mirate a p53 per la terapia del cancro. Tuttavia, nonostante i recenti progressi nella ricerca sulla funzione citoplasmatica di p53, sembra che restino da chiarire vari ruoli oltre alla sua funzione come fattore nucleare. È stato riportato che p53 induce l’apoptosi indipendentemente dalla sua trascrizione dei geni già nel 1994. Sorprendentemente, la p53 attivata può indurre l’apoptosi nel citoplasma da un meccanismo dipendente dal bax.

Questi rapporti indicano che la p53 citoplasmatica può attivare un programma apoptotico indipendente dalla trascrizione. La prossima generazione di approcci terapeutici contro il cancro basati su p53 dovrebbe quindi essere sviluppata per sfruttare questa funzione citosolica. Questo può essere più sicuro che regolare la modulazione della trascrizione di p53 wild-type, che può indurre sia effetti prosurvival che proapoptotici nelle cellule tumorali, come discusso sopra.

Rapporti recenti hanno dimostrato che p53 regola il processo di auto- rinnovamento delle cellule staminali neurali e delle cellule staminali ematopoietiche. Il modello staminale del cancro insiste sul fatto che i tumori sono mantenuti da una piccola popolazione di cellule staminali tumorali che possono dividersi sia simmetricamente che asimmetricamente. La perdita di p53 promuove la leucemia mieloide acuta mediante un auto-rinnovamento aberrante.

È stato segnalato che le cellule staminali mammarie con la mutazione mirata di p53 mostrano le stesse proprietà delle cellule staminali tumorali. La riattivazione di p53 ha ripristinato la divisione cellulare asimmetrica delle cellule staminali tumorali e ha indotto l’inibizione della crescita tumorale. Di conseguenza, un’ulteriore indagine sul legame tra la funzione p53 e le cellule staminali del cancro potrebbe quindi essere uno dei campi di ricerca più importanti per scoprire nuovi paradigmi nella terapia del cancro.