はじめに

細菌細胞間の水平遺伝子伝達（HGT）は、さまざまな環境への細菌の適応に貢献し、長期的には細菌の進化に貢献します（LorenzおよびWackernagel、1994; Bushman、2002; Thomas and Nielsen、2005）。しかし、人間の環境では、病原性、抗生物質耐性、または人工的に操作された遺伝子の望ましくない広がりを引き起こします（Bushman、2002; Keese、2008; Kelly et al。、2009a、b）。細菌におけるHGTの3つのメカニズムが一般的に受け入れられています：接合、形質導入、および形質転換（Bushman、2002; von Wintersdorff et al。、2016）。接合と形質導入には、ドナーからレシピエント細胞へのDNAトランスファーのための特定の装置が含まれます。これらはそれぞれ接合線毛とファージビリオンです。形質転換は主に、細胞外の裸のDNAを取り込む能力を発現するレシピエント細胞の機能です。

形質転換能力は自然または人工的に誘導できますが、すべての細菌種が自然の能力を発達させるわけではありません（Lorenz and Wackernagel、1994; Johnston et al。、2014）。自然に形質転換可能な細菌では、能力は通常一過性であり、生物の成長状態の変化によって誘発されます（Johnston et al。、2014）。個々の細菌種の正確なメカニズムは十分に解明されていないが（Cameron and Redfield、2006、2008; Sinha et al。）、「能力遺伝子」のグループが特定され、一般的なメカニズムモデルが提案されている（Chen and Dubnau、2004）。 。、2009; Seitz and Blokesch、2013; Johnston et al。、2014;JaskólskaandGerdes、2015）。形質転換には細胞外の裸のDNAが基質として必要であるため、裸のDNAを分解するDNaseに対する感受性は、他の形質と区別する上で重要です。 DNase耐性HGTメカニズム（Lorenz and Wackernagel、1994; Giovanetti et al。、2005; Marshall et al。、2010; Rohrer et al。、2012; Blesa and Berenguer、2015）。

一般的に、大腸菌は自然に形質転換できるとは考えられていません。高いCa2 +濃度や温度ショックへの曝露（Mandel and Higa、1970; Hanahan、1983; Sambrook et al。、1989）、ポリエチレングリコールなどの人工条件下でのみ高い遺伝的能力を発揮します。扱うメント（Chung et al。、1989; Sambrook et al。、1989）、または感電（Sambrook and Russell、2006）。しかし、報告によれば、大腸菌は、その自然環境で実行可能な特定の条件下で適度な能力を発現することができます（Baur et al。、1996、Bauer et al。、1999; Tsen et al。、2002; Woegerbauer et al。、2002） 。以下では、プラスミドを外部から追加した形質転換をプラスミド形質転換（PT）と定義し、プラスミドDNAが死んだ細菌細胞（環境から）に由来する形質転換を形質転換による水平方向のプラスミド転移（HPTT）と定義します。

大腸菌は、2つの一般的なメカニズムを含む複数のDNA取り込みメカニズムを持っているようです。1つは、多くのグラム陰性および陽性細菌で一般的に機能する「コンピテンス遺伝子」に依存しています（Finkel and Kolter、2001; Palchevskiy and Finkel、 2006; Sinha et al。、2009; Sinha and Redfield、2012; Seitz and Blokesch、2013; Johnston et al。、2014;JaskólskaandGerdes、2015）このメカニズムは、主に細胞表面の周りに形成された特定の分子装置によって実行されます。細胞膜を通過する構造は、特定のプラスミド周囲ヌクレアーゼを使用して生成された線状の一本鎖DNAのみを通過します。大腸菌では、PTはインタクトなダブルスの取り込みを必要とするため、これらの遺伝子はPTに寄与するとは見なされません。転写された環状DNA（Sinha and Redfield、2012; Johnston et al。、2014）。したがって、このメカニズムが環境内のPTに寄与する可能性は低いです。 2番目のメカニズムは、2価の金属イオン、熱ショック、物理的ストレスなどの外部環境要因に依存するメカニズムです（Mandel and Higa、1970; Hanahan、1983; Yoshida、2007;Rodríguez-Beltránetal。、2013）。これらの刺激は、詳細は不明であるが、環状プラスミドを含む無傷の二本鎖DNAの通過のために、細胞表面に細孔様構造の形成を誘導すると一般に考えられている（Reusch et al。、1986; Reusch and Sadoff、1988; Huang and Reusch、1995; Sun et al。、2013; Asif et al。、2017）。 Ca2 +およびMg2 +イオンは、最も典型的な能力誘導因子です。環境生息地には、これらのイオンが数ミリモル含まれていることが多く、その濃度は、大腸菌で弱いが検出可能な能力を誘発するのに十分です（Baur et al。、1996、Bauer et al。、1999; Maeda et al。、2003）。したがって、このメカニズムは実験室の外の環境で可能です。上記の2つのメカニズムに加えて、別のメカニズムがSun etalによって提案されています。 （2006、2009）、Zhang etal。 （2012）、Guo etal。（2015）、およびSun（2016）では、ABCトランスポーターと特定のペリプラズムおよび内膜タンパク質が関与しています。このメカニズムは、内部の転写調節因子であるRpoSとCRPによって制御されているため、このメカニズムも遺伝的に制御された自然のプロセスであることが示唆されました。

このミニレビューでは、大腸菌を使用したHGTに関する研究を要約します。実験システムを使用して、自然環境での複数のメカニズムによる形質転換の発生の可能性と、抗生物質耐性遺伝子の拡散への影響の可能性について説明します。

自然環境を模倣した条件での大腸菌のプラスミド形質転換

食品抽出物中のPT

ヒト食品は、多くの細菌にとって優れた培養培地です。しかし、成長と生存以外の細菌の生理機能に対する食品の影響にはほとんど注意が払われていません。食品が細菌の形質転換の媒体として機能する可能性を調査しました。食品には、ミリモル濃度の二価金属イオン（Ca2 +およびMg2 +）が含まれていることが多く、冷蔵庫または冷凍庫に保管された後、急速に加温されます（つまり、熱ショックを受けます）。これらの条件は、大腸菌の能力の発達を助長します（Mandel and Higa、1970; Huang and Reusch、1995; Baur et al。、1996）;大腸菌は一般的な食品汚染物質であるため、食品に変換できるかどうかを判断するのは興味深いことです。特定の食品は、実際に大腸菌の能力を誘発する培地として機能する可能性があります（Maeda et al。、2003）。テストされた42の食品サンプルのうち、> 10は、10-7-10-9の頻度で能力を誘発する能力を示しました。これらの中で、豆腐（豆乳を凝固させたチーズのような食品）の上清が最も高い活性（10-7-10-8レシピエント細胞に1つ）を示し、100mMで得られた効率の約半分に相当します。 CaCl2。しかし、形質転換頻度と食品の化学的特性（Ca2 +またはMg2 +濃度およびpH）の間に明確な相関関係はなく、食品内の複雑な要因が能力開発に影響を与えることを示唆しています。形質転換の誘導における食品の同様の効果は、大腸菌（Bauer et al。、1999）および枯草菌（Brautigam et al。、1997; Zenz et al。、1998）で報告されています。

PT in Solid-Air Biofilm

多くのバクテリアは、自然環境と人工環境にバイオフィルムとして存在します（Davey and O’Toole、2000）。バイオフィルムは、固液または固気（SA）界面で形成される微生物の集合体です（Anderl et al。、2000; Carmen et al。、2004）。これらの高密度培養の細胞は互いに相互作用し、遊離プランクトン型と比較して独特の生理学的機能を発現します。大腸菌の形質転換に関する以前の研究は、プランクトン細胞のみに焦点を当てていましたが（Mandel and Higa、1970; Hanahan、1983）、SAバイオフィルム内の大腸菌細胞がさまざまな細胞で10-6-10-8の頻度で能力を発達させることを示しましたLBおよびH2O寒天およびさまざまな湿った食品を含む固形培地（Maeda et al。、2004）。生細胞は一般にバイオフィルム内の死細胞と共存し、後者はそれらのDNAおよびCa2 +やMn2 +を含む特定の二価金属イオンをバイオフィルムの局所微小環境に放出することができます（Davey and O’Toole、2000; Whitchurch et al。、2002 ）。これらの条件は、形質転換の発達を助長する可能性があり、大腸菌気液バイオフィルムの同様の増強も報告されているため、SAバイオフィルムに限定されない可能性があります（Króletal。、2011）。

水中の野生大腸菌株のPT

私たちおよび他の結果は、環境大腸菌が形質転換を介して外来DNAを獲得する可能性があることを示唆しています。しかし、天然の大腸菌株の形質転換性に関する調査の以前の報告はほとんどありません（Woegerbauer et al。、2002; Sinha and Redfield、2012）。したがって、我々は、環境条件下で能力を発達させる天然の大腸菌株の可能性を調べた。天然大腸菌のモデルとして、標準的な大腸菌コレクション（ECOR）株を使用しました（Ochman and Selander、1984）。これらのECOR株は、生理学、行動、および遺伝子型変異に関するさまざまな研究で広く使用されているためです。天然大腸菌（Tenaillon et al。、2010）。一部のECOR株は、5〜35°Cの一定の変動温度および冬季温度で、天然水（市販のボトル入り天然純水）で検出可能な形質転換性（10-10-10-11）を示すことがわかりました。その天然の大腸菌は、環境で実行可能に発生する可能性のある特定の条件下で潜在的に能力を発達させる可能性があります（Matsumoto et al。、2016b）。

大腸菌での形質転換による水平プラスミド転移

天然水および食品抽出物中の凍結融解誘導HPTT

環境では、裸のDNAは、同じ生息地または微小環境内の死んだ細胞から隣接する細胞に自然に供給されます。したがって、いくつかの実行可能な条件下での閉鎖系におけるHPTTの可能性を調査することは価値があります。凍結融解は食品の取り扱いにおける一般的なプロセスであり、自然界でも発生します。大腸菌細胞の凍結融解処理は、死細胞からのDNA漏出と、その後の生存細胞による取り込みを促進する可能性があります。これは、大腸菌が熱ショックに応答し、その場で形質転換するためです（Li et al。、1992; Takahashi et al。、1992）。天然水および食品抽出物中の混合大腸菌株の凝縮懸濁液のこの処理は、10-8-10-10の頻度で非接合プラスミドのinsitu横伝達を引き起こした（Ishimoto et al。、2008）。この現象は、-20°Cで1〜2か月保存した後でも発生し、DNaseに対する感受性は、形質転換メカニズムを介して媒介されることを示しました。

SAバイオフィルムにおけるHPTTの低頻度

バイオフィルムは、生細胞と死細胞が近接して共存し、死細胞から放出されたDNAが生細胞の周囲に蓄積することが多いため、insitu変換に適した環境であると考えられています。さらに、上記のように、大腸菌細胞はSAバイオフィルムで適度な能力を発揮する可能性があるため（Maeda et al。、2004）、これらの要因は両方ともバイオフィルムのHPTTに寄与します。抗生物質を含まない寒天培地上のSAバイオフィルムに非接合プラスミドを保有する株とプラスミドを含まない株を単に共培養することにより、形質転換細胞は24〜48時間以内に低頻度（10-9-10-10）で産生されました。 （前田ほか、2006）。 LBブロスでの同じ株の液体培養は、形質転換体を全くまたはほとんど生成せず、プラスミド転移のためのSAバイオフィルム形成の重要性を示唆している。本質的に、同じ現象が食品ベースの培地上のSAバイオフィルムで発生しました（Ando et al。、2009）。この現象は、溶原性ファージや接合装置を含まないDH5、HB101、MG1655などの一般的な実験室株の間でも発生しました（Etchuuya et al。、2011）。これは、SAバイオフィルムでの水平プラスミド転移の頻度が低いことを示唆しています。ファージや接合機構の助けを借りずに発生するため、このDNA転移は一種の形質転換によるものです。ただし、rpoS-変異はこのHPTTに影響を与えなかったため（Maeda et al。、2006）、RpoS依存メカニズム（Zhang et al。、2012）が関与する可能性は低いです。

HPTTの高頻度P1ファージによって誘導される

水平方向のプラスミド転移のためにいくつかの株とプラスミドの組み合わせを評価することにより、E.coli株CAG18439はプラスミドpHSG299と組み合わせてプラスミドドナーとプラスミドレシピエントの両方として機能することがわかりました。液体培地でも混合細胞培養でプラスミドを頻繁に移すことができた（Etchuuya et al。、2011）。このHGTは、高周波プラスミド導入（10-5-10-8）がDNase感受性であったため、一種の形質転換であることが実証されました。さらなる研究により、この現象はいくつかの特定の特徴を示すことが明らかになりました。（1）CAG18439から放出されたタンパク性因子による促進（Etchuuya et al。、2011）。 （2）pHSG299での88 bpシーケンスによるプロモーション（Sobue et al。、2011）; （3）高い転送頻度（Etchuuya et al。、2011; Sobue et al。、2011）; （4）特定の遺伝子への依存（Kurono et al。、2012; Matsuda et al。、2012）。 （1）に関して、後の研究により、これらのタンパク性因子にはP1virファージ粒子（またはその誘導体）が含まれ、外部から添加されたP1virファージは大腸菌細胞とCAG18439の他の3つの主要な特徴との間の水平プラスミド転移を再現できることが明らかになりました。依存性HPTT（Sugiura et al。、2017）。この現象はまた、主にDNase感受性であり、このプラスミド転移の大部分は、P1ファージの関与にもかかわらず形質転換によるものであることを示唆しています。 P1virファージ誘導性プラスミド転移の形質転換メカニズムは、ファージ感染またはプラスミド保有細胞における溶原化ファージの自発的覚醒に起因する可能性があり、細胞溶解およびその後の形質転換に使用可能な形態での細胞内プラスミドDNA放出をもたらす。このようなメカニズムは一般的に実現可能ですが、大腸菌での明確な実証はほとんどありません。キーンらによる最近の研究。 （2017）他のファージシステムを使用しても、大腸菌で同様のファージ誘導形質転換メカニズムが実証されました。しかし、P1virまたはCAG18439によるHPTTは、ファージ誘導性細胞溶解からのDNA供給の増強だけでは十分に説明できず、その特徴的な特性の点でE. coliでの単純な形質転換（Hanahan、1983）とは異なります（2–4）。 （2）に関して、pHSG299の88 bp配列は、P1ファージゲノム配列の一部と相同ではありません。この配列は、一般的なクローニングベクター配列のデータベースによく見られますが、天然のソースには見られません。しかし、pHSG299の構築プロセスをさかのぼることにより（Hashimoto-Gotoh et al。、1981; Brady et al。、1984; Takeshita et al。、1987）、88bpの配列はR6-5に由来すると思われます。接合Rプラスミド。この配列、および同様のDNAエレメントは、環境内のRおよびその他のプラスミドのHPTTに寄与する可能性があります。 （3）に関しては、同等の培養条件下でのこれらの菌株における単純なPTの頻度が105〜102倍低かったため、この高周波伝達は、CAG18439および使用された他の菌株の単純なPT能力では説明できません（Etchuuya et al。、 2011）。したがって、サイズが9〜30 kDaと推定されるCAG18439由来のタンパク性因子（Etchuuya et al。、2011）もHPTTの促進に関与している可能性があることが示唆されました。この因子は、おそらく形質転換DNAの88 bp配列と組み合わせて、レシピエント細胞によるDNA取り込みを支援すると考えられます。最後に、（4）に関して、HPTTに関与するレシピエント遺伝子のその後のゲノムワイドスクリーニング研究は、複数の遺伝子がメカニズムに関与していることを示唆しました（Kurono et al。、2012; Matsuda et al。、2012; Shibata et al。、2014a ）。これらには、大腸菌の自然または人工の形質転換に関与することが報告されていないもの（rodZなど）およびybaVやyhiRなどのいくつかの既知のコンピテンス遺伝子ホモログが含まれます（FinkelおよびKolter、2001; PalchevskiyおよびFinkel、2006 ）、ただし、rpoSおよびRpoS依存メカニズムに関連する他の遺伝子は含まれません（Zhang et al。、2012）。全体として、これらの結果は、自然変換の経路を部分的に共有している可能性のある、ファージ誘導性の高周波HPTTの未知の複雑なメカニズムを示しています。

自然大腸菌株間のHPTT

E. coli株におけるHPTTの一般性と多様性をさらに評価するために、HPTTの研究では天然株（前述のECOR株）を使用しました。 ECOR株のいくつかの組み合わせを液体培地で共培養し、DNase感受性の天然抗生物質耐性遺伝子の水平伝播をもたらしました（Matsumoto et al。、2016a、b）。これらの新しい形質転換体からのプラスミド単離は、ECOR株間の水平方向のプラスミド転移を示した（Matsumoto et al。、2016a、b）。同じECOR株を使用した単純なPT実験では、同じ培養条件下でHPTTが単純なPT（10-10未満）よりもはるかに頻繁に発生する（10-6-10-8）ことが明らかになり、HPTTがユニークで効果的であることが示唆されました。さらに、ECOR株の12の組み合わせのうち6つがプラーク形成ファージを生成しないことを発見し（Shibata et al。、2014b）、DNase感受性遺伝子導入を示し、HPTTは自然界ではかなり一般的であると疑われました大腸菌株。全体として、これらのデータは、いくつかのファージおよび接合のない形質転換メカニズムがいくつかの大腸菌株にも自然に存在し、抗生物質耐性天然プラスミド（ECOR24株のプラスミドなど：アクセッション番号AB905284およびAB905285）は、多剤耐性の天然大腸菌細胞を産生するための経路となります。

環境中の大腸菌におけるPTおよびHPTTの考えられるメカニズムと実現可能性

PTおよびこのミニレビューで紹介された凍結融解誘発性の低頻度HPTTは、食品や天然水にmMレベルのCa2 +およびMg2 +イオンが含まれていることが多いため、おそらくコンピテンス遺伝子依存メカニズムよりも細孔形成メカニズムに関連しています（Baur et al。、1996、Bauer et al。、1999; Maeda et al。、2003）、およびバイオフィルム環境は、二価金属イオンおよび形質転換プラスミドDNAを含む死細胞の内容物を生細胞に供給する。以前に説明したように（Maeda et al。、2006）、SAバイオフィルム（直径10〜12 mm、厚さ0.5〜0.8 mm）には約2〜5×109個の細胞が含まれています。さらに、哺乳類の腸内細菌は一般に約1011細胞/ gに達します（Zoetendal et al。、2004; Sekirov et al。、2010）。環境の規模が非常に大きいことを考えると、10-9-10-10の変換頻度でさえ、細菌集団に影響を与えるため、過小評価することはできません。

この記事で説明する高周波HPTTには、上記のように、孔形成メカニズムだけでなく、能力遺伝子機能の一部、そしておそらく別の未知のメカニズムもあります。バクテリオファージは生物圏で最も豊富な生物の1つであり、環境に遍在しているため（Clokie et al。、2011）、ファージ誘導HPTTは、通常の形質導入やその他のファージ由来と同様に、環境でも実行可能であると考えられています。 HGTの方法、例えば遺伝子導入剤（Lang et al。、2012）。

結論と展望

全体として、我々の結果と関連する以前のデータは、複数のメカニズムが形質導入を誘導することを示しています-培地の性質（水や食品など）、氷点下から約40°Cまでの可変温度、バイオフィルムの高細胞密度、さまざまな遺伝的背景など、さまざまな環境および細胞環境に基づいた大腸菌のHGTタイプ関与する菌株の。環境中の遺伝的ダイナミクスへの形質転換型HGTの寄与は過小評価されている可能性があり（Bushman、2002; Thomas and Nielsen、2005）、私たちの研究はEにおけるHPTTを示しています。コリは、環境内で実行可能に遭遇する可能性のある条件下で、かなりの転送頻度（10-5-10-10）で発生します。したがって、形質転換型HGTは、抗生物質耐性遺伝子の拡散と、実験室外の実際の環境における多剤耐性菌の出現に寄与する可能性があります。抗生物質耐性の拡大における形質転換型HGTの正確な役割と貢献を理解するには、さらなる研究が必要です。

著者の貢献

HH、ES、およびSMが論文を執筆しました。

資金提供

この作品は日本学術振興会科研費（助成金＃25292051）によって支援されました。

利益相反に関する声明

著者は、この研究は潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない場合に実施されます。

謝辞

英語を提供してくれたEnago（www.enago.jp）に感謝します。編集および校正サービス。