実験方法

信号対雑音比の計算に使用される式が、信号対雑音比に劇的な影響を与える可能性があるのと同じように特定のスペクトルデータセットの見かけの感度、機器のハードウェア構成、およびデータ収集の実験パラメータも、収集されるスペクトルの品質に劇的な影響を及ぼします。

多くのハードウェアパラメータがあります。分光蛍光光度計の測定感度に影響を与える設定とオプション。これにより、2つの異なる機器が実質的に同じ方法で使用されていない場合、それらの相対的な感度を完全に比較することが非常に困難になる可能性があります。以下では、これらの各要因と、それらが結果のデータに与える影響について説明します。

すべての走査型蛍光光度計に適用可能

励起波長：励起波長は、比較するすべてのシステムで同一である必要があります。 HORIBAメソッドは、他のほとんどのメーカーと同様に、水のラマンバンドに350nmの励起を使用します。 350 nmで励起すると、水のラマン発光バンドは397nmにピークがあります。

より良い比較が可能になるため、ほとんどのメーカーがこの励起波長で標準化されているのは幸いです。ただし、異なる波長範囲（NIRなど）で感度をテストする方法として、励起波長を他の値に移動することは完全に有効です。

発光スキャン範囲：HORIBAメソッドは発光モノクロメーターをスキャンします。 365〜450 nm、0.5 nm刻みで、397nmのラマンピーク全体と450nmのバックグラウンドを収集します。

バンド幅（スリットサイズ）：HORIBAメソッドは5nmバンドパスを使用します。励起分光計と発光分光計の両方にスリットがあります。一部のメーカーは、5nmと比較して感度を上げる効果がある10nmスリットを指定しています。モノクロメータの入口と出口の物理的なスリットサイズを2倍にすると、スループットがサイズの2乗に比例するため、励起強度と発光検出スループットが4倍になることが報告されていますが、これは単純な推定値であり、測定する必要があります。経験的に。 HORIBAはHORIBAFluoromaxとの因子差を測定し、Fluoromaxの場合、スリットサイズを5から10 nmに2倍にすると、水のラマンバンドの全体的な信号対雑音比が3倍以上増加することを観察しました。ただし、これはすべての蛍光光度計で異なるため、同じバンドパスと比較しないでください。

積分時間（または応答時間）：これは、検出器が特定の時間に信号を収集できる時間を指します。波長ステップ位置。また、蛍光光度計で測定される全体的な感度にも重要な役割を果たします。 HORIBA方式は、他のメーカーと同様に、各波長点で1秒の積分時間を使用します。ただし、一部のメーカーは2秒の応答時間を指定しており、これにより全体的な信号対雑音比がほぼ2倍になります。比較するときは、必ず同じ積分（応答）時間を使用してください。

PMTタイプ：ほとんどの分光蛍光光度計は、蛍光発光の唯一の検出器として光電子増倍管（PMT）を使用し、検出器のハウジングを変更するオプションはありません。これは、ほとんどのベンチトップ分析蛍光光度計に当てはまります。これらのベンチトップシステムのいくつかは、異なる波長範囲と仕様を持つ異なる個々のPMTの選択を可能にします。他のPMTほどNIRまで検出されないPMTは、ダークカウントが少ないため、350〜400 nmの範囲で信号対雑音比が向上しますが、発光波長全体で使用できない場合があります。特定のラボに必要な範囲。 FluoroMax Plus、Fluorolog3、QuantaMaster 8000シリーズの蛍光光度計で使用されているHORIBAの標準PMTは、蛍光光度計の業界標準と見なされているHamamatsu R928PPMTです。このような場合、可能な場合は、各蛍光光度計が同じPMTを使用していることを確認してください。

光学フィルター：光学フィルターは、励起側または発光側のいずれかで、蛍光光度計の光路に追加できます。サンプルの。これらは、サンプルコンパートメント内のフィルターホルダーに手動で配置することも、さまざまな実験プロトコルが選択されたときにさまざまなフィルターを光路に自動的に配置できるフィルターホイールの一部にすることもできます。光学フィルターは、特定の波長での迷光除去を改善する効果があり、蛍光光度計の信号対雑音比を劇的に改善することができます。 HORIBAは、Fluoromax、Fluorolog3、またはQuantaMaster 8000シリーズの仕様で水ラマンのSNRを指定するときに、走査型分光計自体以外の光学フィルターを使用しません。HORIBA蛍光光度計と自動フィルターを使用する蛍光光度計を比較する場合は、フィルターを使用しないでください。自動の場合は、使用するフィルターのメーカーと種類、使用場所を確認して、同様の実験方法を再現してください。 HORIBA蛍光光度計。

モジュラーリサーチ蛍光光度計に適用

検出器タイプ：モジュラーリサーチ蛍光光度計には通常、PMTハウジングが標準装備されていますが、さまざまなタイプのシングルチャネル検出器で波長を拡張できます。範囲、または機器の蛍光寿命範囲。代替の検出器には、冷却されたPMTハウジング、InGaAs、MCPPMTなどのさまざまな固体検出器が含まれます。これらの異なるタイプの検出器は、特定のサンプル測定の信号対雑音比に劇的な影響を与えるため、ここでも、ある蛍光光度計の感度を別の蛍光光度計と比較する場合は、同じ検出器タイプを使用してデータを収集してください。両方のシステム。

検出器温度：ほとんどの市販の分光蛍光光度計は、冷却されていないPMTハウジングを使用しており、実際、多くの機器は冷却検出器オプションさえ提供していません。冷却されたPMTハウジングは、周囲のハウジング内の同じ正確なPMTと比較して、ダークカウント（バックグラウンド）を減らすことにより、機器の感度を向上させることができます。 FluoroMaxPlus、Fluorolog3、QuantaMaster 8000のHORIBAの標準PMTハウジングはアンビエントPMTハウジングですが、Fluorolog3およびQuantaMaster 8000シリーズは、感度とNIR検出を向上させるためにオプションの冷却PMTハウジングを提供します。モジュラーリサーチ蛍光光度計を比較するときは、必ず同じタイプのPMTハウジング（周囲または冷却）で収集されたデータを比較し、冷却された場合は同じ温度に冷却されます。

シングルモノクロメーターとダブルモノクロメーター：モジュラー研究用蛍光光度計を使用すると、研究者は励起光路または発光光路のいずれかでシングルまたはダブルモノクロメーターを選択できます。ここで、ダブルモノクロメータという用語は、入口スリット、中間スリット、および出口スリットを備えた2つの分散格子ステージを次々と指します。ダブルモノクロメータは、加法モードまたは分散モードのいずれかで構成できますが、いずれの場合も、シングルモノクロメータとダブルモノクロメータのスループットと迷光特性は大きく異なり、ウォーターラマンスキャンのSNRに大きな影響を与えます。帯域幅、積分時間、および波長がすべて一定に保たれている場合でも。

グレーティングの溝密度：グレーティングの溝密度もスループットに影響し、したがって分光蛍光計の感度にも影響します。ほとんどの分光蛍光光度計では、システムは1つの特定のグレーティングのみで製造されているため、これはそれほど問題にはなりません。この場合、最も重要なことは、バンドパスが同じになるように選択されていることを確認することです。ただし、モジュラー蛍光光度計の場合、異なるグレーティングまたは複数のグレーティングを使用してモノクロメータを構成できます。これらのシステムでは、物事をできるだけ類似させるように非常に注意する必要があります。たとえば、焦点距離分光計が類似している2つの機器がある場合、グレーティングの溝密度を変更すると、同じ5nmバンドパス設定の感度が増減します。 HORIBA法は、1ミリメートルあたり1,200溝の溝密度のグレーティングを使用します。

グレーティングのブレイズ角度：励起または発光モノクロメータ用に選択されたグレーティングは、ブレイズと呼ばれる特定の波長帯域で最適なスループットを提供しますこれは、グレーティング表面に与えられたグレーティングエッチングの角度によって決定されるためです。そのようなものとして、350nmのブレーズド励起モノクロメーターと400nmの発光モノクロメーターを備えた励起モノクロメーターは、350nmで励起したときに最高の水ラマン感度を達成するための最適な選択です。ほとんどの蛍光光度計ではグレーティングを調整できないため、この変数は要因ではありませんが、グレーティングを選択できる場合は、有効な比較を行うために、同じまたは非常に類似したブレイズ角度のグレーティングを選択してください。 。