소개

박테리아 세포 사이의 수평 유전자 전달 (HGT)은 다양한 환경에 대한 박테리아 적응에 기여하고 장기적으로는 박테리아 진화에 기여합니다 (Lorenz and Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas and Nielsen, 2005). 그러나 인간 환경에서는 병원성, 항생제 내성 또는 인공적으로 조작 된 유전자의 바람직하지 않은 확산을 유발합니다 (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). 박테리아에서 HGT의 세 가지 메커니즘이 일반적으로 허용됩니다 : 접합, 형질 도입 및 형질 전환 (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). 접합 및 형질 도입은 기증자에서 수용자 세포로의 DNA 전달을위한 특정 장치를 포함합니다. 이들은 각각 conjugative pili 및 phage virions입니다. 형질 전환은 주로 세포 외 네이 키드 DNA를 흡수하는 능력을 발현하는 수용 세포의 기능입니다.

변환 능력은 자연적으로 또는 인위적으로 유도 될 수 있지만 모든 박테리아 종이 자연적 능력을 개발하는 것은 아닙니다 (Lorenz and Wackernagel, 1994; Johnston). et al., 2014). 자연적으로 변형 가능한 박테리아에서 능력은 일반적으로 일시적이고 유기체의 성장 상태의 변화에 의해 유도됩니다 (Johnston et al., 2014). 개별 박테리아 종에 대한 정확한 메커니즘이 충분히 설명되지 않았지만 “역량 유전자”그룹이 확인되었으며 일반적인 기계 론적 모델이 제안되었습니다 (Chen and Dubnau, 2004). (Cameron and Redfield, 2006, 2008; Sinha et al ., 2009; Seitz and Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska and Gerdes, 2015). 형질 전환은 기질로 세포 외 네이 키드 DNA를 필요로하기 때문에 네이 키드 DNA를 분해하는 DNase에 대한 민감성은 형질 전환을 다른 것과 구별하는 데 중요합니다. DNase 내성 HGT 메커니즘 (Lorenz and Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa and Berenguer, 2015).

일반적으로 대장균은 자연적으로 변형 될 수있는 것으로 여겨지지 않습니다. 높은 Ca2 + 농도 및 온도 충격에 대한 노출 (Mandel and Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), 폴리에틸렌 글리콜에 대한 노출을 포함하여 인공 조건에서만 높은 유전 적 능력을 개발합니다. 치료하다 ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989) 또는 전기 충격 (Sambrook and Russell, 2006). 그러나보고 된 바에 따르면 대장균은 자연 환경에서 가능한 특정 조건 하에서 적당한 능력을 표현할 수 있습니다 (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002). . 다음에서는 플라스미드가 외부에서 플라스미드 형질 전환 (PT)으로 추가 된 형질 전환과 플라스미드 DNA가 죽은 박테리아 세포 (환경에서 유래)에서 나오는 형질 전환을 수평 플라스미드 형질 전환 (HPTT)으로 정의합니다.

대장균은 두 가지 인기있는 것을 포함하여 여러 가지 DNA 흡수 메커니즘을 가지고있는 것으로 보입니다. 하나는 많은 그람 음성 및 양성 박테리아에서 일반적으로 작동하는 “역량 유전자”에 의존합니다 (Finkel and Kolter, 2001; Palchevskiy and Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha and Redfield, 2012; Seitz and Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska and Gerdes, 2015).이 메커니즘은 주로 세포 표면 주위에 형성된 특정 분자 장치에 의해 수행됩니다. 특정 periplasmic nuclease를 사용하여 생산 된 선형 단일 가닥 DNA 만 세포막을 통과하는 구조입니다. E. coli에서는 PT가 intact double-s의 흡수를 필요로하기 때문에 이러한 유전자가 PT에 기여하는 것으로 간주되지 않습니다. 트랜디 드 원형 DNA (Sinha and Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). 따라서이 메커니즘이 환경에서 PT에 기여할 가능성은 낮습니다. 두 번째 메커니즘은 2가 금속 이온, 열 충격 및 물리적 스트레스와 같은 외부 환경 요인에 의존한다는 것입니다 (Mandel and Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). 이러한 자극은 일반적으로 원형 플라스미드를 포함한 손상되지 않은 이중 가닥 DNA의 전달을 위해 세포 표면에 기공과 같은 구조의 형성을 유도하는 것으로 간주되지만 세부 사항은 아직 명확하지 않습니다 (Reusch et al., 1986; Reusch and Sadoff, 1988; Huang and Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Ca2 + 및 Mg2 + 이온은 가장 일반적인 역량 유도 요소입니다. 환경 서식지에는 종종 몇 밀리몰의 이온이 포함되어 있는데, 그 농도는 E. coli에서 약하지만 탐지 가능한 능력을 유발하기에 충분합니다 (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). 따라서이 메커니즘은 실험실 외부 환경에서 가능합니다. 위의 두 가지 메커니즘 외에도 Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) 및 Sun (2016), ABC 수송 체와 특정 주변 세포질 및 내부 막 단백질이 관여합니다. 이 메커니즘은 내부 전사 조절 인 RpoS 및 CRP에 의해 조절되므로이 메커니즘도 유 전적으로 제어되는 자연 과정이라고 제안되었습니다.

이 미니 리뷰에서는 E. coli를 사용한 HGT에 대한 연구를 요약합니다. 실험 시스템과 자연 환경에서 여러 메커니즘에 의한 변형 발생 가능성과 항생제 내성 유전자의 확산에 미치는 영향에 대해 논의합니다.

자연 환경을 모방 한 조건에서 대장균의 플라스미드 변형

식품 추출물의 PT

인간 식품은 많은 박테리아에 대한 우수한 배양 배지입니다. 그러나 성장과 생존을 제외하고는 식품이 박테리아 생리학에 미치는 영향에 대해서는 거의 관심을 기울이지 않았습니다. 우리는 음식이 박테리아 형질 전환을위한 매개체로 작용할 가능성을 조사했습니다. 식품에는 종종 밀리몰 농도의 2가 금속 이온 (Ca2 + 및 Mg2 +)이 포함되어 있으며 종종 냉장고 나 냉동고에 보관 한 후 급속 가열 (즉, 열 충격)합니다. 이러한 조건은 E. coli의 역량 개발에 도움이됩니다 (Mandel 및 Higa, 1970; Huang and Reusch, 1995; Baur et al., 1996); E. coli는 일반적인 식품 오염 물질이기 때문에 식품에서 변형 될 수 있는지 여부를 확인하는 것이 흥미 롭습니다. 특정 식품은 실제로 대장균에서 역량을 유도하는 매체 역할을 할 수 있습니다 (Maeda et al., 2003). 테스트 한 42 개의 식품 샘플 중 > 10은 10-7-10-9의 빈도로 역량을 유도하는 능력을 나타 냈습니다. 이 중 두부 상층 액 (두유 두유로 만든 치즈 같은 식품)은 100mM으로 얻은 효율의 약 절반에 해당하는 가장 높은 활성을 나타 냈습니다 (10-7-10-8 수용 세포 중 하나). CaCl2. 그러나 변형 빈도와 식품의 화학적 특성 (Ca2 + 또는 Mg2 + 농도 및 pH) 사이에는 명확한 상관 관계가 없었으며, 이는 식품 내의 복합 요인이 역량 개발에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. E. coli (Bauer et al., 1999) 및 Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998)에서 형질 전환을 유도하는 식품의 유사한 효과가보고되었습니다.

PT in 고체 공기 생물막

많은 박테리아가 자연 및 인공 환경에서 생물막으로 존재합니다 (Davey and O’Toole, 2000). 생물막은 고체-액체 또는 고체-공기 (SA) 계면에서 형성되는 미생물 집합체입니다 (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). 이러한 고밀도 배양에서 세포는 서로 상호 작용하고 자유 플랑크톤 형태와 비교하여 독특한 생리 기능을 표현합니다. E. coli 형질 전환에 대한 이전 연구는 플랑크톤 세포에만 초점을 맞추었지만 (Mandel and Higa, 1970; Hanahan, 1983), SA 생물막 내의 E. coli 세포가 다양한 환경에서 10-6-10-8의 빈도로 능력을 발달시키는 것으로 나타났습니다. LB 및 H2O 한천 및 다양한 축축한 식품을 포함한 고체 배지 (Maeda et al., 2004). 살아있는 세포는 일반적으로 생물막에서 죽은 세포와 공존하며, 후자는 DNA와 Ca2 + 및 Mn2 +를 포함한 특정 2가 금속 이온을 생물막의 국소 미세 환경으로 방출 할 수 있습니다 (Davey and O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). 이러한 조건은 형질 전환 개발에 도움이 될 수 있으며 대장균 공기-액체 생물막의 유사한 향상도보고 되었기 때문에 SA 생물막에만 국한되지 않을 수 있습니다 (Król et al., 2011).

PT of Wild E. coli Strains in Water

우리와 다른 사람들의 결과는 환경 E. coli가 잠재적으로 형질 전환을 통해 외부 DNA를 획득 할 수 있음을 시사합니다. 그러나 천연 대장균 균주의 형질 전환 가능성에 대한 조사에 대한 이전 보고서는 거의 없습니다 (Woegerbauer et al., 2002; Sinha and Redfield, 2012). 따라서 우리는 환경 조건에서 능력을 개발하기 위해 천연 대장균 균주의 잠재력을 조사했습니다. 우리는 천연 대장균 (Ochman and Selander, 1984)의 모델로 표준 E. coli 참조 모음 (ECOR) 균주를 사용했습니다. 왜냐하면 이러한 ECOR 균주는 생리학, 행동 및 유전형 변이에 대한 다양한 연구에서 널리 사용 되었기 때문입니다. 천연 대장균 (Tenaillon et al., 2010). 우리는 일부 ECOR 균주가 5 ~ 35 ° C 사이의 일정하고 다양한 온도와 현장 실험에서 겨울 온도에서 천연 수 (시중에서 판매되는 천연 순수 병)에서 검출 가능한 변형성 (10-10-10-11)을 나타냄을 발견했습니다. 자연 대장균은 환경에서 실행 가능한 특정 조건 하에서 잠재적으로 능력을 개발할 수 있습니다 (Matsumoto et al., 2016b).

대장균의 변형에 의한 수평 플라스미드 전달

자연수 및 식품 추출물의 동결-해동 유도 HPTT

환경에서 네이 키드 DNA는 자연적으로 죽은 세포에서 동일한 서식지 또는 미세 환경 내의 인접 세포로 공급 될 수 있습니다.따라서 일부 가능한 조건에서 폐쇄 시스템에서 HPTT의 가능성을 조사하는 것이 좋습니다. 동결-해동은 식품 취급의 일반적인 과정이며 자연에서도 발생합니다. E. coli 세포의 동결-해동 처리는 죽은 세포에서 DNA 누출을 촉진하고 열 충격에 반응하여 생존 세포에 의한 후속 흡수를 촉진하여 in situ 변형을 초래할 수 있습니다 (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). 자연수와 식품 추출물에서 혼합 된 E. coli 균주의 응축 된 현탁액을 처리하면 10-8-10-10의 빈도로 비 접합 플라스미드의 현장 측면 이동이 발생했습니다 (Ishimoto et al., 2008). 이 현상은 −20 ° C에서 1 ~ 2 개월 보관 후에도 발생했으며 DNase에 대한 민감도는 변형 메커니즘을 통해 매개됨을 보여주었습니다.

SA Biofilms에서 HPTT의 낮은 빈도

바이오 필름은 살아있는 세포와 죽은 세포가 가까이에 공존하고 죽은 세포에서 방출 된 DNA가 종종 살아있는 세포 주위에 축적되기 때문에 현장 변환에 적합한 환경으로 생각됩니다. 또한, 위에서 설명한 바와 같이 대장균 세포는 SA 생물막에서 적당한 능력을 개발할 수 있기 때문에 (Maeda et al., 2004), 두 요인 모두 생물막에서 HPTT에 기여합니다. 항생제가없는 한천 배지의 SA 생물막에 비 접합 플라스미드를 포함하는 플라스미드없는 균주를 단순히 공동 배양함으로써 형질 전환 된 세포가 24–48 시간 내에 낮은 빈도 (10-9-10-10)로 생산되었습니다. (Maeda et al., 2006). LB 배지에서 동일한 균주의 액체 배양은 형질 전환 체를 전혀 또는 거의 생성하지 않았으며, 이는 플라스미드 전달을위한 SA 생물막 형성의 중요성을 시사합니다. 본질적으로 식품 기반 미디어의 SA 생물막에서도 동일한 현상이 발생했습니다 (Ando et al., 2009). 이 현상은 DH5, HB101 및 MG1655 (Etchuuya et al., 2011)와 같은 인기있는 실험실 균주 사이에서도 발생했으며, 이는 용해성 파지가없고 접합 장치가없는 것으로 SA 생물막에서 수평 플라스미드 전달의 빈도가 낮을 수 있음을 시사합니다. 파지 또는 접합 기계의 도움없이 발생하므로 이러한 DNA 전달은 일종의 변형 때문입니다. 그러나 rpoS- 돌연변이가이 HPTT에 영향을 미치지 않았기 때문에 (Maeda et al., 2006), RpoS 의존 메커니즘 (Zhang et al., 2012)이 관련 될 가능성이 낮습니다.

HPTT의 높은 빈도 P1 파지에 의해 유도

수평 플라스미드 전달을위한 여러 균주 및 플라스미드의 조합을 평가함으로써 대장균 균주 CAG18439는 플라스미드 pHSG299 및 플라스미드와 조합하여 플라스미드 공여자 및 플라스미드 수용자 역할을하는 것으로 밝혀졌습니다. 액체 배지에서도 혼합 세포 배양에서 플라스미드를 자주 옮길 수 있습니다 (Etchuuya et al., 2011). 이 HGT는 고주파 플라스미드 전달 (10-5-10-8)이 DNase에 민감하기 때문에 형질 전환의 한 유형으로 입증되었습니다. 추가 연구에 따르면이 현상은 다음과 같은 특정 특징을 나타냅니다. (1) CAG18439에서 방출 된 단백질 성 인자에 의한 촉진 (Etchuuya et al., 2011); (2) pHSG299에서 88-bp 서열에 의한 승격 (Sobue et al., 2011); (3) 높은 전달 주파수 (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); 및 (4) 특정 유전자에 대한 의존성 (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). (1)과 관련하여, 이후 연구에서 이러한 단백질 성 인자에는 P1vir 파지 입자 (또는 이의 유도체)가 포함되며 외부에서 추가 된 P1vir 파지가 대장균 세포와 CAG18439의 세 가지 다른 주요 특징 사이의 수평 플라스미드 이동을 재현 할 수 있음이 밝혀졌습니다. -의존적 HPTT (Sugiura et al., 2017). 이 현상은 또한 대체로 DNase에 민감하여이 플라스미드 전달의 상당 부분이 P1 파지의 관련에도 불구하고 형질 전환에 기인 함을 시사합니다. P1vir 파지-유도 된 플라스미드 전달의 형질 전환 메커니즘은 파지 감염 또는 플라스미드-수집 세포에서 용해 된 파지의 자발적인 각성으로 인한 것일 수 있으며, 이로 인해 세포 용해 및 후속적인 세포 내 플라스미드 DNA 방출이 형질 전환에 사용 가능한 형태로 발생합니다. 이러한 메커니즘은 일반적으로 가능하지만 E. coli에서는 이에 대한 명확한 시연이 거의 없습니다. Keen et al.의 최근 연구. (2017)은 다른 파지 시스템을 사용하여 E. coli에서 유사한 파지 유도 형질 전환 메커니즘을 보여주었습니다. 그러나 P1vir 또는 CAG18439에 의한 HPTT는 파지 유도 세포 용해로 인한 DNA 공급 강화만으로는 적절하게 설명 할 수 없으며 대장균의 단순 형질 전환 (Hanahan, 1983)과는 독특한 특성 (2-4)이 다릅니다. (2)와 관련하여 pHSG299의 88-bp 서열은 P1 파지 게놈 서열의 일부와 상 동성이 없습니다. 이 서열은 일반적인 클로닝 벡터 서열 중 데이터베이스에서 종종 발견되지만 천연 소스에서는 발견되지 않습니다. 그러나 pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987)의 구축 과정을 추적함으로써 88-bp 서열이 R6-5, a 접합성 R 플라스미드.이 서열 및 유사한 DNA 요소는 환경에서 R 및 기타 플라스미드의 HPTT에 기여할 수 있습니다. (3)과 관련하여 이러한 고주파 전달은 CAG18439 및 사용 된 다른 균주의 단순 PT 능력으로 설명 할 수 없습니다. 동일한 배양 조건에서 해당 균주의 단순 PT가 105 ~ 102 배 덜 빈번했기 때문입니다 (Etchuuya et al., 2011). 따라서 CAG18439 유래 단백질 성 인자 (크기가 9 ~ 30kDa로 추정 됨)도 HPTT 촉진에 관여 할 수 있다고 제안되었습니다. 이 인자는 아마도 형질 전환 DNA의 88-bp 서열과 결합하여 수용 세포에 의한 DNA 흡수를 돕습니다. 마지막으로, (4)와 관련하여, HPTT에 관련된 수용자 유전자에 대한 이후의 게놈 전체 스크리닝 연구는 여러 유전자가 메커니즘에 참여 함을 시사했습니다 (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). 여기에는 E. coli (예 : rodZ)의 자연적 또는 인공적 형질 전환에 관여하지 않는 것으로보고되지 않은 것과 ybaV 및 yhiR과 같은 몇 가지 알려진 능력 유전자 동족체 (Finkel and Kolter, 2001; Palchevskiy and Finkel, 2006)가 포함됩니다. ), 그러나 rpoS 및 RpoS 의존성 메커니즘과 관련된 기타 유전자는 포함하지 않습니다 (Zhang et al., 2012). 전반적으로 이러한 결과는 자연적 변형 경로를 부분적으로 공유 할 수있는 파지 유도 고주파 HPTT의 알려지지 않은 복잡한 메커니즘을 가리 킵니다.

자연 대장균 균주 간의 HPTT

E. coli 균주에서 HPTT의 일반 성과 다양성을 추가로 평가하기 위해 천연 균주 (앞서 언급 한 ECOR 균주)가 HPTT 연구에 사용되었습니다. ECOR 균주의 여러 조합을 액체 배지에서 공동 배양하여 자연 항생제 내성 유전자의 DNase에 민감한 수평 이동을 초래했습니다 (Matsumoto et al., 2016a, b). 이러한 새로운 형질 전환 체로부터의 플라스미드 분리는 ECOR 균주 간의 수평 플라스미드 전달을 입증했습니다 (Matsumoto et al., 2016a, b). 동일한 ECOR 균주를 사용하는 간단한 PT 실험은 동일한 배양 조건에서 HPTT가 단순 PT (10-10 미만)보다 훨씬 더 자주 (10-6-10-8) 발생하는 것으로 나타 났으며, 이는 HPTT가 독특하고 효과적임을 시사했습니다. 더욱이, 우리는 ECOR 균주의 12 개 조합 중 6 개 조합 (일부는 플라크 형성 파지를 생성하지 않음 (Shibata et al., 2014b))이 DNase에 민감한 유전자 전달을 나타내어 HPTT가 자연에서 다소 흔하다고 의심하게합니다. E. coli 균주. 전반적으로, 이러한 데이터는 일부 대장균 균주 및 항생제 내성 천연 플라스미드의 HPTT (예 : ECOR24 균주의 플라스미드 : 수탁 번호 AB905284 및 수탁 번호 AB905284)에도 일부 파지 및 접합이없는 형질 전환 메커니즘 (들)이 자연적으로 존재 함을 시사합니다. AB905285)는 다제 내성 천연 대장균 세포를 생산하는 경로가 될 수 있습니다.

환경의 대장균에서 PT 및 HPTT의 가능한 메커니즘 및 타당성

PT 및 이 미니 리뷰에서 소개 된 동결-해동 유도 및 저주파 HPTT는 아마도 능력 유전자 의존 메커니즘보다 기공 형성 메커니즘과 더 관련이있을 것입니다. 음식과 자연수에는 종종 mM 수준의 Ca2 + 및 Mg2 + 이온이 포함되어 있기 때문입니다 (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), 생물막 환경은 살아있는 세포에 2가 금속 이온과 형질 전환 가능한 플라스미드 DNA를 포함한 죽은 세포의 함량을 공급합니다. 앞에서 설명한 것처럼 (Maeda et al., 2006) SA 생물막 (직경, 10-12mm, 두께, 0.5–0.8mm)에는 약 2–5 x 109 개의 세포가 포함되어 있습니다. 또한 포유류의 장내 세균은 일반적으로 약 1011 세포 / g에 이릅니다 (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). 엄청난 규모의 환경을 고려할 때 10-9-10-10의 형질 전환 빈도조차도 박테리아 개체군에 영향을 미치므로 과소 평가할 수 없습니다.

이 기사에 설명 된 고주파 HPTT가 관련 될 수 있습니다. 기공 형성 메커니즘뿐만 아니라 능력 유전자 기능의 일부이며 위에서 언급 한 또 다른 알려지지 않은 메커니즘도 있습니다. 박테리오파지는 생물권에서 가장 풍부한 유기체 중 하나이고 환경에서 편재하기 때문에 (Clokie et al., 2011), 파지 유도 HPTT는 일반 형질 도입 및 기타 파지 유래 환경에서도 가능하다고 간주됩니다. HGT의 방법, 예. 유전자 전달 인자 (Lang et al., 2012).

결론 및 관점

전반적으로 우리의 결과 및 관련 이전 데이터는 여러 메커니즘이 변형을 유도함을 나타냅니다. 배지의 특성 (예 : 물과 음식), 영하에서 ~ 40 ° C까지 다양한 온도, 생물막의 높은 세포 밀도 및 다양한 유전 적 배경과 같은 다양한 환경 및 세포 환경을 기반으로 한 대장균에서 HGT 유형 관련된 균주의. 환경의 유전 역학에 대한 형질 전환 형 HGT의 기여는 과소 평가 될 수 있으며 (Bushman, 2002; Thomas and Nielsen, 2005), 우리의 연구에 따르면 E.대장균은 환경에서 발생할 수있는 조건 하에서 상당한 전달 주파수 (10-5-10-10)에서 발생합니다. 따라서 형질 전환 형 HGT는 실험실 외부의 실제 환경에서 항생제 내성 유전자의 확산과 다제 내성 세균의 출현에 기여할 수있다. 항생제 내성 확산에있어 형질 전환 형 HGT의 정확한 역할과 기여를 이해하려면 더 많은 연구가 필요합니다.

저자 기고

HH, ES, SM이 논문을 썼습니다.

기금

이 연구는 JSPS KAKENHI (Grant # 25292051)의 지원을 받았습니다.

이해 상충 성명

저자는 연구가 이해의 상충 가능성이있는 것으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 진행됩니다.

사인

영어에 대해 Enago (www.enago.jp)에게 감사드립니다. 편집 및 교정 서비스.