실험 방법

신호 대 잡음비를 계산하는 데 사용되는 공식이 특정 스펙트럼 데이터 세트의 겉보기 감도, 기기의 하드웨어 구성 및 데이터 수집의 실험 매개 변수도 수집 된 스펙트럼의 품질에 극적인 영향을 미칩니다.

많은 하드웨어 매개 변수가 있습니다. 분광형 광계의 측정 된 감도에 영향을 미치는 설정 및 옵션. 이로 인해 사실상 동일한 방식으로 사용되지 않는 경우 서로 다른 두 기기의 상대 감도를 절대적으로 비교하기가 매우 어려울 수 있습니다. 아래에서는 이러한 각 요소와 결과 데이터에 미치는 영향에 대해 설명합니다.

모든 스캐닝 형광 계에 적용 가능

여기 파장 : 여기 파장은 비교되는 모든 시스템에서 동일해야합니다. HORIBA 방법은 대부분의 다른 제조업체와 마찬가지로 물의 라만 밴드에 350nm 여기를 사용합니다. 350nm에서 여기 될 때 물에 대한 라만 방출 대역은 397nm에서 피크를 갖습니다.

다행히도 대부분의 제조업체는 더 나은 비교를 허용하기 때문에이 여기 파장을 표준화했습니다. 그러나 다른 파장 범위 (예 : NIR)에서 감도를 테스트하는 방법으로 여기 파장을 다른 값으로 이동하는 것은 완벽하게 유효합니다.

방출 스캔 범위 : HORIBA 방법은 방출 모노 크로 메이터를 스캔합니다. 365 ~ 450nm에서 0.5nm 씩 증가하여 397nm에서 전체 라만 피크와 450nm에서 배경을 수집합니다.

대역폭 (슬릿 크기) : HORIBA 방법은 5nm 대역 통과를 사용합니다. 여기 및 방출 분광계 모두에서 슬릿. 일부 제조업체는 5nm에 비해 감도를 높이는 효과가있는 10nm 슬릿을 지정합니다. 모노 크로 메이터의 입구와 출구에서 물리적 슬릿 크기를 두 배로 늘리면 처리량이 크기의 제곱으로 증가하기 때문에 여기 강도와 방출 감지 처리량을 4 배로 늘릴 수 있다고보고되었지만 이는 측정해야하는 단순한 추정치입니다. 경험적으로. HORIBA는 HORIBA Fluoromax를 사용하여 계수 차이를 측정했으며, Fluoromax의 경우 슬릿 크기를 5nm에서 10nm로 두 배로 늘리면 물의 라만 밴드에 대한 전체 신호 대 잡음 비율이 3 배 이상 증가한다는 것을 관찰했습니다. 그러나 이것은 모든 형광 계에서 다를 수 있으므로 동일한 대역 통과와 비교해야합니다.

통합 시간 (또는 응답 시간) : 이것은 검출기가 주어진 시간에서 신호를 수집 할 수있는 시간을 나타냅니다. 파장 단계 위치. 또한 형광 계로 측정 된 전체 감도에서 중요한 역할을합니다. HORIBA 방법은 다른 제조업체와 마찬가지로 각 파장 지점에서 1 초의 통합 시간을 사용합니다. 그러나 일부 제조업체는 2 초 응답 시간을 지정하여 전체 신호 대 잡음 비율을 거의 2 배로 증가시킵니다. 비교할 때 동일한 통합 (응답) 시간을 사용해야합니다.

PMT 유형 : 대부분의 분광형 광계는 검출기 하우징을 변경하는 옵션없이 광전자 증 배관 (PMT)을 유일한 형광 방출 검출기로 사용합니다. 이것은 대부분의 벤치 탑 분석 형광 계에 해당됩니다. 이러한 벤치 탑 시스템 중 일부는 파장 범위와 사양이 다른 다양한 개별 PMT를 선택할 수 있습니다. 다른 PMT만큼 근적외선까지 감지하지 못하는 PMT는 더 낮은 다크 카운트를 가지므로 350 ~ 400nm 범위에서 더 나은 신호 대 잡음비를 제공하지만 전체 방출 파장에서 사용하지 못할 수 있습니다. 특정 실험실에서 원하는 범위. FluoroMax Plus, Fluorolog3 및 QuantaMaster 8000 시리즈 형광 계에 사용되는 HORIBA의 표준 PMT는 형광 계의 산업 표준으로 간주되는 Hamamatsu R928P PMT입니다. 이러한 경우 가능한 경우 각 형광 계가 동일한 PMT를 사용하고 있는지 확인하십시오.

광학 필터 : 여기 측 또는 방출 측에서 형광 계의 광학 경로에 광학 필터를 추가 할 수 있습니다. 샘플의. 이들은 샘플 컴 파트먼트 내부의 필터 홀더에 수동으로 배치하거나 다른 실험 프로토콜이 선택 될 때 다른 필터를 광학 경로에 자동으로 배치 할 수있는 필터 휠의 일부일 수 있습니다. 광학 필터는 주어진 파장에서 미광 제거를 개선하는 효과가 있으며 형광 계의 신호 대 잡음비를 크게 향상시킬 수 있습니다. HORIBA는 Fluoromax, Fluorolog3 또는 QuantaMaster 8000 시리즈 사양으로 물 라만에 대한 SNR을 지정할 때 스캐닝 분광계 자체를 제외하고는 광학 필터를 사용하지 않습니다.HORIBA 형광 계와 자동 필터를 사용하는 형광 계를 비교할 때 필터를 사용하지 마십시오. 자동 인 경우 필터의 제조업체와 유형 및 사용 위치를 확인하여 유사한 실험 방법을 복제하십시오. HORIBA 형광 계.

모듈 식 연구 형광 계에 적용 가능

검출기 유형 : 모듈 식 연구 형광 계는 일반적으로 PMT 하우징을 표준으로 포함하지만 다양한 유형의 단일 채널 검출기를 사용하여 파장을 확장 할 수 있습니다. 범위 또는 기기의 형광 수명 범위. 대체 검출기에는 냉각 PMT 하우징, InGaAs, MCP PMT 등과 같은 다양한 고체 검출기가 포함됩니다. 이러한 다양한 유형의 검출기는 특정 샘플 측정의 신호 대 잡음비에 극적인 영향을 미치므로 여기서 다시 한 번 형광 계의 감도를 다른 형광 계와 비교하려고 할 때 동일한 검출기 유형을 사용하여 데이터를 수집해야합니다. 두 시스템.

검출기 온도 : 대부분의 상용 분광형 광계는 냉각되지 않은 PMT 하우징을 사용하며 실제로 많은 기기는 냉각 검출기 옵션도 제공하지 않습니다. 냉각 된 PMT 하우징은 주변 하우징의 동일한 정확한 PMT에 비해 다크 카운트 (배경)를 줄여 기기의 감도를 향상시킬 수 있습니다. FluoroMaxPlus, Fluorolog3 및 QuantaMaster 8000에있는 HORIBA의 표준 PMT 하우징은 앰비언트 PMT 하우징이지만 Fluorolog3 및 QuantaMaster 8000 시리즈는 감도와 NIR 감지를 개선하기 위해 냉각 형 PMT 하우징 옵션을 제공합니다. 모듈 식 연구 형광 계를 비교할 때는 동일한 유형의 PMT 하우징 (주변 또는 냉각)으로 수집 된 데이터를 비교하고 냉각 된 경우 동일한 온도로 냉각되도록하십시오.

단일 대 이중 모노 크로 메이터 : 모듈 식 연구 형광 계를 사용하면 연구원은 여기 또는 방출 광 경로에서 단일 또는 이중 단색광을 선택할 수 있습니다. 여기서 이중 모노 크로 메이터라는 용어는 입구 슬릿, 중간 슬릿 및 출구 슬릿이있는 두 개의 분산 격자 단계를 차례로 나타냅니다. 이중 모노 크로 메이터는 추가 또는 분산 모드로 구성 할 수 있지만, 두 경우 모두 단일 모노 크로 메이터와 이중 모노 크로 메이터의 처리량 및 미광 특성은 크게 다르며 수중 라만 스캔의 SNR에 큰 영향을 미칩니다. 대역폭, 통합 시간 및 파장이 모두 일정하게 유지되는 경우에도 마찬가지입니다.

Groove Density of Grating : Grating의 Groove 밀도도 처리량에 영향을 미치므로 분광형 광계의 감도에 영향을줍니다. 대부분의 분광형 광계의 경우 시스템이 하나의 특정 격자로만 제조되기 때문에 이는 큰 문제가 아닙니다. 이 경우 가장 중요한 것은 대역 통과가 동일하게 선택되도록하는 것입니다. 그러나 모듈 형 형광 계의 경우 다른 격자 또는 다중 격자로 모노 크로 메이터를 구성 할 수 있습니다. 이러한 시스템의 경우 가능한 한 유사하게 유지하도록 매우주의해야합니다. 예를 들어 초점 거리 분광기가 유사한 두 기기가있는 경우 격자의 홈 밀도를 변경하면 동일한 5nm 대역 통과 설정에 대한 감도가 증가하거나 감소합니다. HORIBA 방법은 밀리미터 당 1,200 그루브의 그루브 밀도를 가진 격자를 사용합니다.

Blaze Angle of Grating : 여기 또는 방출 모노 크로 메이터에 대해 선택된 격자는 블레이즈라고하는 특정 파장 대역에서 최적의 처리량을 제공합니다. 각도는 격자 표면에 부여 된 격자 에칭 각도에 의해 결정되기 때문입니다. 350nm 블레이즈 여기 모노 크로 메이터와 400nm 방출 모노 크로 메이터가있는 여기 모노 크로 메이터는 350nm에서 여기 될 때 최상의 물 라만 감도를 달성하기위한 최적의 선택이 될 것입니다. 대부분의 형광 계는 격자 조정을 허용하지 않기 때문에이 변수는 요인이 아니지만 격자를 선택할 수있는 경우에는 동일한 또는 매우 유사한 블레이즈 각도를 가진 격자를 선택하여 유효한 비교를 확인하십시오. .