Innledning

Horisontal genoverføring (HGT) mellom bakterieceller bidrar til bakteriell tilpasning til forskjellige miljøer og på lang sikt til bakteriell evolusjon (Lorenz og Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas og Nielsen, 2005). Imidlertid forårsaker det i menneskelige miljøer uønsket spredning av patogenisitet, antibiotikaresistens eller kunstig konstruerte gener (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Tre mekanismer for HGT i bakterier er generelt akseptert: konjugasjon, transduksjon og transformasjon (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Konjugering og transduksjon involverer spesifikt apparat for DNA-overføring fra donor til mottakerceller; disse er henholdsvis konjugative pili- og fagvirioner. Transformasjon er primært en funksjon av mottakerceller som uttrykker kompetanse til å ta opp ekstracellulært nakent DNA.

Transformasjonskompetanse kan være indusert naturlig eller kunstig, men ikke alle bakteriearter utvikler naturlig kompetanse (Lorenz og Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). I naturlig transformerbare bakterier er kompetanse vanligvis forbigående og indusert av endringer i veksttilstanden til organismen (Johnston et al., 2014). En gruppe «kompetansegener» er identifisert, og generelle mekanistiske modeller er blitt foreslått (Chen og Dubnau, 2004), selv om presise mekanismer for individuelle bakteriearter ikke er belyst i tilstrekkelig grad (Cameron og Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz og Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska og Gerdes, 2015). Fordi transformasjon krever ekstracellulært naken DNA som substrat, er følsomhet for DNase, som nedbryter naken DNA, nøkkelen til å skille transformasjon fra andre DNase-resistente HGT-mekanismer (Lorenz og Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa and Berenguer, 2015).

Generelt, Escherichia coli antas ikke å være naturlig transformerbar; den utvikler høy genetisk kompetanse bare under kunstige forhold, inkludert eksponering for høye Ca2 + konsentrasjoner og temperatursjokk (Mandel og Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polyetylenglykol behandle ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989), eller elektrisk støt (Sambrook og Russell, 2006). Imidlertid kan E. coli angivelig uttrykke beskjeden kompetanse under visse betingelser som er gjennomførbare i dets naturlige miljøer (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . I det følgende definerer vi transformasjon hvor plasmid ble tilsatt eksternt som plasmidtransformasjon (PT) og transformasjon hvor plasmid-DNA kommer fra døde bakterieceller (fra omgivelsene) som horisontal plasmidoverføring ved transformasjon (HPTT).

Escherichia coli ser ut til å ha flere DNA-opptaksmekanismer, inkludert to populære: en som er avhengig av «kompetansegenene», som ofte fungerer i mange gramnegative og positive bakterier (Finkel og Kolter, 2001; Palchevskiy og Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha and Redfield, 2012; Seitz and Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska and Gerdes, 2015). Denne mekanismen utføres hovedsakelig av det spesifikke molekylære apparatet som dannes rundt celleoverflaten. struktur som passerer gjennom cellemembranene bare lineært enkeltstrenget DNA produsert ved bruk av en spesifikk periplasmisk nuklease. I E. coli anses disse genene ikke å bidra til PT fordi PT krever opptak av intakte dobbelts trandert sirkulært DNA (Sinha og Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Derfor er det lite sannsynlig at denne mekanismen bidrar til PT i miljøet. Den andre mekanismen er den avhengig av eksterne miljøfaktorer, som toverdige metallioner, varmesjokk og fysiske påkjenninger (Mandel og Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Disse stimuli anses ofte å indusere dannelsen av porelignende strukturer i celleoverflaten for overføring av intakt dobbeltstrenget DNA, inkludert sirkulære plasmider, selv om detaljene forblir uklare (Reusch et al., 1986; Reusch og Sadoff, 1988; Huang og Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Ca2 + og Mg2 + -ioner er de mest typiske kompetanseinduserende faktorene. Miljøhabitater inneholder ofte flere millimolare av disse ionene, hvis konsentrasjoner er tilstrekkelig til å indusere svak, men påviselig kompetanse i E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Derfor er denne mekanismen mulig i miljøet utenfor laboratorier. I tillegg til de to ovennevnte mekanismene er det foreslått en annen mekanisme av Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) og Sun (2016), der en ABC-transportør og spesifikke periplasmiske og indre membranproteiner er involvert. Denne mekanismen er regulert av interne transkripsjonsregulatorer, RpoS og CRP, derfor ble det antydet at denne mekanismen også er en genetisk kontrollert naturlig prosess.

I denne mini-oversikten oppsummerer vi våre studier på HGT ved bruk av E. coli eksperimentelle systemer og diskutere mulig forekomst av transformasjon ved flere mekanismer i naturlige miljøer og dens mulige innvirkning på spredning av antibiotikaresistensgener.

Plasmidtransformasjon av E. coli i forhold som etterligner naturlig miljø

PT i matekstrakter

Menneskelig mat er utmerket kulturmedium for mange bakterier. Imidlertid har lite oppmerksomhet blitt viet til effekten av mat på bakteriell fysiologi annet enn vekst og overlevelse. Vi undersøkte muligheten for at matvarer fungerer som medier for bakteriell transformasjon. Matvarer inneholder ofte millimolære konsentrasjoner av toverdige metallioner (Ca2 + og Mg2 +) og lagres ofte i kjøleskap eller fryser, etterfulgt av rask oppvarming (dvs. varme sjokkert). Disse forholdene bidrar til utvikling av kompetanse i E. coli (Mandel og Higa, 1970; Huang og Reusch, 1995; Baur et al., 1996); fordi E. coli er en vanlig matforurensning, er det interessant å avgjøre om den kan transformeres i matvarer. Visse matvarer kan faktisk fungere som medier som induserer kompetanse i E. coli (Maeda et al., 2003). Av 42 testede matprøver viste > 10 en evne til å indusere kompetanse med en frekvens på 10−7−10−9. Blant disse viste supernatanten fra tofu (en ostlignende mat laget av ostemelk soyamelk) den høyeste aktiviteten (en i 10–7−10-8 mottakerceller), tilsvarende omtrent halvparten av effektiviteten oppnådd med 100 mM CaCl2. Imidlertid var det ingen klare sammenhenger mellom transformasjonsfrekvenser og kjemiske egenskaper for matvarene (Ca2 + eller Mg2 + konsentrasjoner og pH), noe som tyder på at komplekse faktorer i maten påvirker kompetanseutviklingen. Lignende effekter av matvarer ved å indusere transformasjon er rapportert i E. coli (Bauer et al., 1999) og Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT i Solid-Air Biofilm

Mange bakterier finnes som biofilm i naturlige og kunstige miljøer (Davey og O’Toole, 2000). Biofilm er aggregater av mikrober som dannes ved grensesnitt med fast væske eller fast luft (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Celler i disse kulturer med høy tetthet samhandler med hverandre og uttrykker særegne fysiologiske funksjoner sammenlignet med deres frie planktoniske former. Tidligere studier om E. coli-transformasjon fokuserte utelukkende på planktoniske celler (Mandel og Higa, 1970; Hanahan, 1983), men vi viste at E. coli-celler innen SA biofilm utvikler kompetanse med en frekvens på 10−6−10−8 på forskjellige faste medier, inkludert LB og H2O agar og forskjellige fuktige matvarer (Maeda et al., 2004). Levende celler eksisterer vanligvis sammen med døde celler i biofilmer, og sistnevnte kan frigjøre DNA og visse toverdige metallioner, inkludert Ca2 + og Mn2 +, i det lokale mikromiljøet til biofilmen (Davey og O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Disse forholdene kan være gunstige for utvikling av transformasjon og kan ikke være eksklusive for SA-biofilmer, siden en lignende forbedring i E. coli luft-væske-biofilm også er rapportert (Król et al., 2011).

PT of Wild E. coli Stammer in Water

Våre og andres resultater antyder at miljømessige E. coli potensielt kan tilegne seg fremmed DNA via transformasjon. Imidlertid er det få tidligere rapporter om undersøkelser av transformerbarheten av naturlige E. coli-stammer (Woegerbauer et al., 2002; Sinha og Redfield, 2012). Derfor undersøkte vi potensialet til naturlige E. coli-stammer for å utvikle kompetanse under miljøforhold. Vi brukte en standard E. coli-samling av referansestammer (ECOR) -stammer som vår modell av naturlige E. coli (Ochman og Selander, 1984) fordi disse ECOR-stammene har blitt mye brukt i ulike studier på fysiologi, atferd og genotypisk variasjon av naturlig E. coli (Tenaillon et al., 2010). Vi fant at noen ECOR-stammer utviste påvisbar transformerbarhet (10−10−10-11) i naturlig vann (kommersielt tilgjengelig naturlig rent vann på flaske) ved konstante og varierende temperaturer mellom 5 og 35 ° C og ved vintertemperaturer i et felteksperiment, noe som antydet at naturlig E. coli potensielt kan utvikle kompetanse under visse forhold som mulig kan forekomme i miljøet (Matsumoto et al., 2016b).

Horisontal plasmidoverføring ved transformasjon i E. coli

Fryse-tine-indusert HPTT i naturlige vann og matekstrakter

I miljøet kan naken DNA naturlig tilføres fra døde celler til naboceller i samme habitat eller mikromiljø.Derfor er det verdt å undersøke muligheten for HPTT i et lukket system under noen mulige forhold. Fryse – tine er en vanlig prosess i håndtering av matvarer og forekommer også i naturen. Frys-tine-behandling av E. coli-celler kan fremme DNA-lekkasje fra døde celler og etterfølgende opptak av overlevende celler fordi de reagerer på varmesjokk, noe som resulterer i transformasjon in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Denne behandlingen av kondenserte suspensjoner av blandede E. coli-stammer i naturlig vann og matekstrakter forårsaket in situ lateral overføring av ikke-konjugative plasmider med en frekvens på 10−8−10-10 (Ishimoto et al., 2008). Dette fenomenet skjedde også selv etter 1-2 måneders lagring ved -20 ° C, og dets følsomhet overfor DNase viste at det ble formidlet via en transformasjonsmekanisme.

Lav frekvens av HPTT i SA Biofilms

Biofilm antas å være egnet miljø for transformasjon in situ fordi levende og døde celler eksisterer like i nærheten, og DNA som frigjøres fra døde celler ofte akkumuleres rundt levende celler. I tillegg, som beskrevet ovenfor, fordi E. coli celler kan utvikle beskjeden kompetanse i SA biofilm (Maeda et al., 2004), bidrar begge disse faktorene til HPTT i biofilm. Ved ganske enkelt å dyrke en plasmidfri stamme med en som har et ikke-konjugativt plasmid i en SA-biofilm på antibiotikafritt agarmedium, ble transformerte celler produsert ved lav frekvens (10−9−10-10) innen 24–48 timer (Maeda et al., 2006). Væskekulturer av de samme stammene i LB-buljong produserte ingen eller få transformanter, noe som tyder på viktigheten av SA-biofilmdannelse for plasmidoverføring. I hovedsak skjedde det samme fenomenet i SA-biofilmer på matbaserte medier (Ando et al., 2009). Dette fenomenet skjedde også mellom populære laboratoriestammer som DH5, HB101 og MG1655 (Etchuuya et al., 2011), som er lysogene fagfrie og konjugative apparatfrie, noe som tyder på at den lave frekvensen av horisontal plasmidoverføring i SA biofilm kan forekomme uten hjelp av fag- eller konjugeringsmaskineri, og derfor at denne DNA-overføringen skyldes en slags transformasjon. Men siden rpoS- mutasjon ikke påvirket denne HPTT (Maeda et al., 2006), er det lite sannsynlig at den RpoS-avhengige mekanismen (Zhang et al., 2012) vil være involvert.

Høy frekvens av HPTT Indusert av P1-fag

Ved å vurdere kombinasjoner av flere stammer og plasmider for horisontal plasmidoverføring, ble E. coli-stammen CAG18439 funnet å fungere som både en plasmid-donor og en plasmidmottaker i kombinasjon med plasmidet pHSG299 og ofte kunne overføre plasmidet i en blandet cellekultur selv i et flytende medium (Etchuuya et al., 2011). Denne HGT ble demonstrert å være en type transformasjon fordi høyfrekvent plasmidoverføring (10-5-10-10) var DNase-sensitiv. Ytterligere studier avslørte at dette fenomenet viser noen spesifikke egenskaper: (1) promotering av proteinholdig faktor frigjort fra CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) promotering av en 88 bp sekvens på pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) høy overføringsfrekvens (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); og (4) avhengighet av spesifikke gener (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Med hensyn til (1) avslørte en senere studie at disse proteinholdige faktorene inkluderer en P1vir-fagpartikkel (eller et derivat derav) og at eksternt tilsatt P1vir-fag kan reprodusere horisontal plasmidoverføring mellom E. coli-celler og de tre andre hovedtrekkene i CAG18439 avhengig HPTT (Sugiura et al., 2017). Dette fenomenet var også stort sett DNase-sensitivt, noe som tyder på at en stor del av denne plasmidoverføringen skyldes transformasjon til tross for involvering av P1-fag. Transformasjonsmekanismen for P1vir-fagindusert plasmidoverføring kan være på grunn av faginfeksjon eller spontan oppvåkning av lysogenisert fag i plasmid-husende celler, noe som fører til cellelyse og påfølgende intracellulær plasmid-DNA-frigjøring i en brukbar form for transformasjon. Selv om en slik mekanisme generelt er mulig, har det vært få klare demonstrasjoner av den i E. coli. En fersk studie av Keen et al. (2017) ved bruk av annet fagsystem demonstrerte også en lignende fagindusert transformasjonsmekanisme i E. coli. Imidlertid kan HPTT av P1vir eller CAG18439 ikke forklares tilstrekkelig bare med forbedret DNA-tilførsel fra fagindusert cellelyse, og det skiller seg fra enkel transformasjon i E. coli (Hanahan, 1983) når det gjelder dets særegne egenskaper (2–4). Med hensyn til (2) er 88-bp-sekvensen på pHSG299 ikke homolog med den delen av P1-faggenomsekvensen. Denne sekvensen finnes ofte i databaser blant generelle kloningsvektorsekvenser, men ikke i noen naturlig kilde. Ved å spore byggeprosessen til pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), mistenker vi imidlertid at 88-bp sekvensen stammer fra R6-5, a konjugativ R-plasmid.Denne sekvensen og lignende DNA-elementer kan bidra til HPTT av R og andre plasmider i miljøet. Med hensyn til (3), kan denne høyfrekvente overføringen ikke forklares med den enkle PT-evnen til CAG18439 og andre stammer som ble brukt fordi enkel PT i de stammene under tilsvarende kulturforhold var 105-102 ganger sjeldnere (Etchuuya et al., 2011). Det ble derfor antydet at en CAG18439-avledet proteinholdig faktor, med størrelse estimert mellom 9 og 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) også kunne være involvert i å fremme HPTT. Denne faktoren hjelper antagelig i DNA-opptak av mottakerceller, sannsynligvis i kombinasjon med 88-bp-sekvensen på transformerende DNA. Til slutt, med hensyn til (4), foreslo senere genomomfattende screeningstudier for mottakergener involvert i HPTT at flere gener deltok i mekanismen (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Disse inkluderer de som ikke er rapportert å være involvert i naturlig eller kunstig transformasjon i E. coli (for eksempel rodZ) og noen få kjente kompetanse-genhomologer, som ybaV og yhiR (Finkel og Kolter, 2001; Palchevskiy og Finkel, 2006 ), men inkluderer ikke rpoS og andre gener relatert til den RpoS-avhengige mekanismen (Zhang et al., 2012). Samlet sett peker disse resultatene mot en ukjent, kompleks mekanisme av fagindusert, høyfrekvent HPTT som delvis kan dele veien for naturlig transformasjon.

HPTT mellom naturlige E. coli-stammer

For ytterligere å vurdere allmenheten og variasjonen av HPTT i E. coli-stammer, ble naturlige stammer (de nevnte ECOR-stammene) brukt i en studie av HPTT. Flere kombinasjoner av ECOR-stammer ble kultivert i flytende medier, noe som resulterte i DNase-sensitiv horisontal overføring av naturlige antibiotikaresistensgener (Matsumoto et al., 2016a, b). Plasmidisolasjon fra disse nye transformantene viste horisontal plasmidoverføring mellom ECOR-stammer (Matsumoto et al., 2016a, b). Enkle PT-eksperimenter med de samme ECOR-stammene avslørte at HPTT forekommer mye oftere (10−6−10−8) enn enkel PT (under 10–10) under de samme kulturforholdene, noe som antydet at HPTT er unik og effektiv. Videre oppdaget vi at 6 av 12 kombinasjoner av ECOR-stammene, hvorav noen ikke produserer plakkdannende fager (Shibata et al., 2014b), viste DNase-sensitiv genoverføring, noe som førte oss til å mistenke at HPTT er ganske vanlig i naturlig E. coli-stammer. Samlet sett antyder disse dataene at noen fag- og konjugasjonsfri transformasjonsmekanismer også eksisterer naturlig i noen E. coli-stammer, og at HPTT av antibiotikaresistente naturlige plasmider (som plasmider av ECOR24-stammen: Adgangsnummer AB905284 og AB905285) kan være en vei for å produsere multiresistente naturlige E. coli-celler.

Mulige mekanismer og gjennomførbarhet av PT og HPTT i E. coli i miljøet

Eksempler på PT og fryse – tineindusert og lavfrekvent HPTT introdusert i denne mini-gjennomgangen er sannsynligvis mer relatert til den poredannende mekanismen enn kompetansen genavhengig mekanisme fordi mat og naturlig vann ofte inneholder mM nivåer av Ca2 + og Mg2 + ioner (Baur et. al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), og biofilm-miljøet forsyner levende celler med innholdet av døde celler, inkludert toverdige metallioner og transformerbart plasmid-DNA. Som vi har beskrevet tidligere (Maeda et al., 2006), inneholder en SA biofilm (diameter, 10–12 mm; tykkelse, 0,5–0,8 mm) ca. 2-5 × 109 celler. I tillegg utgjør tarmbakterier i pattedyr generelt omtrent 1011 celler / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Med tanke på den enorme omfanget av miljøet, kan ikke transformasjonsfrekvenser på 10−9−10−10 undervurderes, da de vil ha en innvirkning på bakteriepopulasjonen.

Høyfrekvent HPTT beskrevet i denne artikkelen kan involvere ikke bare den poredannende mekanismen, men også en del av kompetansegenet fungerer og muligens en annen ukjent mekanisme, som nevnt ovenfor. Fordi bakteriofager er en av de mest utbredte organismer i biosfæren og allestedsnærværende i miljøet (Clokie et al., 2011), anses fagindusert HPTT også å være gjennomførbart i miljøet, så vel som vanlig transduksjon og andre fagavledede. måter for HGT, f.eks. genoverføringsmidler (Lang et al., 2012).

Konklusjon og perspektiv

Samlet viser våre resultater og relaterte tidligere data at flere mekanismer induserer transformasjon- type HGT i E. coli basert på ulike miljømessige og cellulære omstendigheter som medienes art (f.eks. vann og mat), variabel temperatur fra under null til ~ 40 ° C, høy celletetthet i biofilm og varierende genetisk bakgrunn av de involverte stammene. Bidraget fra transformasjonstype HGT til genetisk dynamikk i miljøet kan undervurderes (Bushman, 2002; Thomas og Nielsen, 2005), og våre studier indikerer at HPTT i E.coli forekommer ved betydelige overføringsfrekvenser (10−5−10−10) under de forhold som det mulig kan oppstå i miljøet. Derfor kan transformasjonstypen HGT bidra til spredning av antibiotikaresistensgener og fremveksten av multiresistente bakterier i det virkelige miljøet utenfor laboratorier. Ytterligere studier er nødvendige for å forstå den presise rollen og bidraget til transformasjonstypen HGT i spredning av antibiotikaresistens.

Forfatterbidrag

HH, ES og SM skrev papiret.

Finansiering

Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Erklæring om interessekonflikt

Forfatterne erklærer at forskningen var gjennomført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Anerkjennelser

Vi er takknemlige til Enago (www.enago.jp) for engelsk redigering og korrekturlesingstjenester.