Eksperimentell metode

Akkurat som formelen som brukes til å beregne signal til støyforhold kan ha en dramatisk effekt på tilsynelatende følsomhet for et bestemt spektral datasett, maskinvarekonfigurasjonen til instrumentet og de eksperimentelle parametrene for datainnsamlingen, har også en dramatisk effekt på kvaliteten på det ervervede spekteret.

Det er mange maskinvareparametere, innstillinger og alternativer som alle har en effekt på den målte følsomheten til et spektrofluorometer. Dette kan gjøre det ekstremt vanskelig å absolutt sammenligne den relative følsomheten til to forskjellige instrumenter, hvis de ikke brukes på en nesten identisk måte. Nedenfor diskuterer vi hver av disse faktorene og hvilken innvirkning de har på de resulterende dataene.

Gjelder for alle skannende fluorometre

Excitasjonsbølgelengde: Excitasjonsbølgelengden skal være identisk for alle systemer som sammenlignes. HORIBA-metoden bruker 350 nm eksitasjon for Raman-båndet med vann, som de fleste andre produsenter gjør. Når det er spennende ved 350 nm, har Raman-utslippsbåndet for vann en topp på 397 nm.

Det er heldig at de fleste produsenter har standardisert på denne eksitasjonsbølgelengden, da det gir bedre sammenligning. Imidlertid er det helt gyldig å flytte magnetiseringsbølgelengden til en hvilken som helst annen verdi som en måte å teste følsomhet i et annet bølgelengdeområde (f.eks. NIR).

Utslippsskanneområde: HORIBA-metoden skanner utslippsmonokromatoren. fra 365 til 450 nm, med trinn på 0,5 nm, for å samle hele Raman-toppen ved 397 nm og også bakgrunnen ved 450 nm.

Båndbredde (spaltestørrelse): HORIBA-metoden bruker 5 nm båndpass spalter på både eksitasjon og emisjonsspektrometre. Noen produsenter spesifiserer 10 nm spalter som har den effekten at de øker følsomheten sammenlignet med 5 nm. Det er rapportert at dobling av den fysiske spaltestørrelsen ved inngangen og utgangen til en monokromator kan firedoble intensiteten til eksitasjon og utslippsdeteksjon gjennomstrømningen siden gjennomstrømningen går når kvadratet på størrelsen øker, men dette er et forenklet estimat som skal måles empirisk. HORIBA har målt faktorforskjellen med HORIBA Fluoromax, og observert at for Fluoromax øker dobling av spaltenes størrelse fra 5 til 10 nm det totale signal / støyforholdet for Raman-båndet med en faktor på mer enn 3 ganger. Dette vil imidlertid være annerledes for alle fluorometre, så vær sikker på at du ikke kan sammenligne med identiske båndpass.

Integrasjonstid (eller responstid): Dette refererer til hvor lenge detektoren har lov til å samle et signal på en gitt trinnposisjon for bølgelengde. Det spiller også en viktig rolle i den totale følsomheten målt for et fluorometer. HORIBA-metoden bruker 1 sekunders integrasjonstid på hvert bølgelengdepunkt, i likhet med andre produsenter. Noen produsenter spesifiserer imidlertid en responstid på 2 sekunder som øker det totale signal / støyforholdet med nesten en faktor på to. Sørg for å bruke samme integrasjonstid (responstid) når du sammenligner.

PMT Type: De fleste spektrofluorometre bruker et fotomultiplikatorrør (PMT) som eneste detektor for fluorescensemisjon, uten mulighet for å endre detektorhuset. Dette gjelder for de fleste analytiske fluorometre på benken. Noen av disse benkesystemene tillater valg av forskjellige individuelle PMT-er med forskjellige bølgelengdeområder og spesifikasjoner. PMT-er som ikke oppdager så langt inn i NIR som andre PMT-er, vil ha et lavere mørketall, slik at de vil gi et bedre signal / støy-forhold i området 350 til 400 nm, men de kan ikke brukes i hele utslippsbølgelengden ønsket område for et bestemt laboratorium. HORIBAs standard PMT brukt i FluoroMax Plus, Fluorolog3 og QuantaMaster 8000-serien av fluorometre, er Hamamatsu R928P PMT, som regnes som industristandard for fluorometer. I disse tilfellene, vær sikker på at hvert fluorometer bruker samme PMT, der det er mulig.

Optiske filtre: Et optisk filter kan legges til den optiske banen til et fluorometer, enten på eksitasjonssiden eller utslippssiden av prøven. Disse kan plasseres manuelt i en filterholder inne i prøveområdet, eller de kan være en del av et filterhjul som automatisk kan plassere forskjellige filtre i den optiske banen når forskjellige eksperimentelle protokoller er valgt. Optiske filtre har den virkningen at de forbedrer avvisende lysavvisning ved gitte bølgelengder, og de kan dramatisk forbedre signal / støyforholdet til et fluorometer. HORIBA bruker ikke noen optiske filtre, bortsett fra selve skanningspektrometrene, når de spesifiserer SNR for vann Raman med spesifikasjonene Fluoromax, Fluorolog3 eller QuantaMaster 8000-serien.Når du sammenligner et HORIBA fluorometer med et fluorometer som bruker automatiserte filtre, må du ikke bruke et filter, eller hvis det er automatisk, bekreft hvilket merke og type filtre som brukes, og hvor de brukes, for å replikere en lignende eksperimentell metode med et HORIBA fluorometer.

Gjelder for modulære forskningsfluorometre

Detektortype: Modulære forskningsfluorometre inkluderer vanligvis et PMT-hus som standard, men tillater mange forskjellige typer enkeltkanaldetektorer for å utvide bølgelengden rekkevidde eller fluorescens levetid for et instrument. Alternative detektorer inkluderer avkjølte PMT-hus, forskjellige solid state-detektorer som InGaA, MCP PMT og så videre. Disse forskjellige typene detektorer vil ha dramatiske effekter på signal / støyforholdet til en bestemt prøvemåling, så her igjen, når du prøver å sammenligne følsomheten til et fluorometer mot et annet, må du være sikker på at samme detektortype brukes til å samle inn data på begge systemene.

Detektortemperatur: De fleste kommersielle spektrofluorometre bruker PMT-hus som ikke er avkjølt, og faktisk har mange instrumenter ikke engang et avkjølt detektoralternativ. Et avkjølt PMT-hus kan forbedre følsomheten til et instrument ved å redusere mørketellingen (bakgrunn) sammenlignet med den samme eksakte PMT i et omgivende hus. HORIBAs standard PMT-hus i FluoroMaxPlus, Fluorolog3 og QuantaMaster 8000 er omgivende PMT-hus, men Fluorolog3 og QuantaMaster 8000-serien tilbyr valgfrie avkjølte PMT-hus for å forbedre følsomheten og NIR-deteksjon. Når du sammenligner modulære forskningsfluorometre, må du sørge for å sammenligne data som er samlet inn med samme type PMT-hus (omgivende eller avkjølt), og hvis avkjølt, så også avkjølt til samme temperatur.

Single Versus Double Monochromator: Modular forskningsfluorometre tillater en forsker å velge enkle eller doble monokromatorer på enten eksitasjon eller utslipp optisk bane. Her refererer begrepet dobbel monokromator til to dispergerende ristetrinn, den ene etter den andre, med en inngangsspalte, mellomliggende spalte og utgangsspalte. En dobbel monokromator kan konfigureres enten i additiv eller dispersiv modus, men i begge tilfeller er gjennomstrømningen og stray light-egenskapene til en enkelt versus en dobbel monokromator veldig forskjellige, og vil ha stor innvirkning på SNR for en vann-Raman-skanning, selv om båndbredder, integreringstider og bølgelengder holdes konstant.

Ristetetthet av gitter: Rilletettheten til et gitter vil også påvirke gjennomstrømningen, og dermed følsomheten til et spektrofluorometer. For de fleste spektrofluorometre er dette ikke så mye et problem fordi systemene er produsert med bare ett bestemt gitter. I dette tilfellet er det viktigste å sikre at båndpassene er valgt for å være de samme. For modulære fluorometre kan du imidlertid konfigurere monokromatorer med forskjellige gitter eller flere gitter. For disse systemene må du være veldig forsiktig med å holde ting så like som mulig. For eksempel når du har to instrumenter som har lignende brennvidde-spektrometre, vil endring av rilletettheten på gitteret øke eller redusere følsomheten for den samme 5 nm båndpassinnstillingen. HORIBA-metoden bruker gitter med en grovetetthet på 1200 spor per millimeter.

Blaze Angle of Grating: Gitterene valgt for en eksitasjons- eller emisjonsmonokromator gir optimal gjennomstrømning ved et bestemt bølgelengdebånd, referert til som flammen vinkelen siden dette bestemmes av vinkelen på gitteretsningen gitt på gitteroverflaten. Som sådan ville en eksitasjonsmonokromator med en 350 nm flammet eksitasjonsmonokromator og en 400 nm utslippsmonokromator være optimale valg for å oppnå den beste Raman-følsomheten når det var spennende ved 350 nm. Siden de fleste fluorometre ikke tillater deg å justere gitteret, er denne variabelen ikke en faktor, men for de som tillater deg å velge gitter, må du sørge for å velge gitter med samme, eller veldig lignende, flammevinkel for å gjøre en gyldig sammenligning .