Inleiding

Horizontale genoverdracht (HGT) tussen bacteriële cellen draagt bij aan bacteriële aanpassing aan verschillende omgevingen en, op lange termijn, aan bacteriële evolutie (Lorenz en Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas en Nielsen, 2005). In menselijke omgevingen veroorzaakt het echter ongewenste verspreiding van pathogeniteit, antibioticaresistentie of kunstmatig gemanipuleerde genen (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Drie mechanismen van HGT in bacteriën worden algemeen aanvaard: conjugatie, transductie en transformatie (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Bij conjugatie en transductie is een specifiek apparaat betrokken voor DNA-overdracht van donor- naar ontvangercellen; dit zijn respectievelijk conjugatieve pili- en faagvirionen. Transformatie is in de eerste plaats een functie van ontvangende cellen die de competentie uitdrukken om extracellulair naakt DNA op te nemen.

Transformatiecompetentie kan natuurlijk of kunstmatig worden geïnduceerd, maar niet alle bacteriesoorten ontwikkelen natuurlijke competentie (Lorenz en Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). Bij van nature transformeerbare bacteriën is competentie meestal van voorbijgaande aard en wordt deze veroorzaakt door veranderingen in de groeitoestand van organismen (Johnston et al., 2014). Er is een groep ‘competentiegenen’ geïdentificeerd en er zijn algemene mechanistische modellen voorgesteld (Chen en Dubnau, 2004), hoewel precieze mechanismen voor individuele bacteriesoorten niet voldoende zijn opgehelderd (Cameron en Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz en Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska en Gerdes, 2015). Omdat transformatie extracellulair naakt DNA als substraat vereist, is gevoeligheid voor DNase, dat naakt DNA afbreekt, de sleutel tot het onderscheiden van transformatie van andere DNase-resistente HGT-mechanismen (Lorenz en Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa en Berenguer, 2015).

In het algemeen Van Escherichia coli wordt niet aangenomen dat het van nature transformeerbaar is; het ontwikkelt alleen een hoge genetische competentie onder kunstmatige omstandigheden, waaronder blootstelling aan hoge Ca2 + -concentraties en temperatuurschokken (Mandel en Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polyethyleenglycol traktatie ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989), of elektrische schokken (Sambrook en Russell, 2006). Naar verluidt kan E. coli echter een bescheiden competentie tot uitdrukking brengen onder bepaalde omstandigheden die haalbaar zijn in zijn natuurlijke omgeving (Baur et al., 1996; Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . Hieronder definiëren we transformatie waarbij plasmide extern werd toegevoegd als plasmide-transformatie (PT) en transformatie waarbij plasmide-DNA afkomstig is van dode bacteriële cellen (uit de omgeving) als horizontale plasmide-overdracht door transformatie (HPTT).

Escherichia coli lijkt meerdere DNA-opnamemechanismen te bezitten, waaronder twee populaire: een die afhankelijk is van de ‘competentiegenen’, die gewoonlijk werken in veel gramnegatieve en -positieve bacteriën (Finkel en Kolter, 2001; Palchevskiy en Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha en Redfield, 2012; Seitz en Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska en Gerdes, 2015) Dit mechanisme wordt voornamelijk geleid door het specifieke moleculaire apparaat gevormd rond het celoppervlak structuur, die door de celmembranen gaat, alleen lineair enkelstrengs DNA geproduceerd met behulp van een specifiek periplasmatisch nuclease. In E. coli worden deze genen niet geacht bij te dragen aan PT omdat PT de opname vereist van intacte dubbelstrengs tranded circulair DNA (Sinha en Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Daarom is het onwaarschijnlijk dat dit mechanisme bijdraagt aan PT in het milieu. Het tweede mechanisme is dat afhankelijk van externe omgevingsfactoren, zoals tweewaardige metaalionen, hitteschok en fysieke spanningen (Mandel en Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Van deze stimuli wordt algemeen aangenomen dat ze de vorming van porie-achtige structuren in het celoppervlak induceren voor het passeren van intact dubbelstrengs DNA, inclusief circulaire plasmiden, hoewel de details onduidelijk blijven (Reusch et al., 1986; Reusch en Sadoff, 1988; Huang en Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Ca2 + – en Mg2 + -ionen zijn de meest typische competentie-inducerende factoren. Milieuhabitats bevatten vaak meerdere millimolaire van deze ionen, waarvan de concentraties voldoende zijn om zwakke maar detecteerbare competentie in E. coli te induceren (Baur et al., 1996; Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Daarom is dit mechanisme mogelijk in de omgeving buiten laboratoria. Naast de bovenstaande twee mechanismen is een ander mechanisme voorgesteld door Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015), en Sun (2016), waarin een ABC-transporter en specifieke periplasmatische en binnenmembraaneiwitten betrokken zijn. Dit mechanisme wordt gereguleerd door interne transcriptionele regulatoren, RpoS en CRP, daarom werd gesuggereerd dat dit mechanisme ook een genetisch gecontroleerd natuurlijk proces is.

In deze mini-review vatten we onze studies over HGT samen met E. coli experimentele systemen en bespreken het mogelijke optreden van transformatie door meerdere mechanismen in natuurlijke omgevingen en de mogelijke impact ervan op de verspreiding van antibiotica-resistentiegenen.

Plasmide-transformatie van E. coli in omstandigheden die de natuurlijke omgeving nabootsen

PT in voedselextracten

Menselijk voedsel is een uitstekend kweekmedium voor veel bacteriën. Er is echter weinig aandacht besteed aan de effecten van voedingsmiddelen op de bacteriële fysiologie anders dan groei en overleving. We onderzochten de mogelijkheid dat voedingsmiddelen fungeren als medium voor bacteriële transformatie. Levensmiddelen bevatten vaak millimolaire concentraties van tweewaardige metaalionen (Ca2 + en Mg2 +) en worden vaak bewaard in een koelkast of vriezer, gevolgd door snelle opwarming (d.w.z. hitteschok). Deze omstandigheden zijn bevorderlijk voor de ontwikkeling van competentie bij E. coli (Mandel en Higa, 1970; Huang en Reusch, 1995; Baur et al., 1996); Omdat E. coli een veel voorkomende voedselverontreiniger is, is het interessant om te bepalen of het kan worden omgezet in voedingsmiddelen. Bepaalde voedingsmiddelen kunnen inderdaad fungeren als media die competentie opwekken bij E. coli (Maeda et al., 2003). Van de 42 geteste voedselmonsters vertoonden > 10 het vermogen om competentie op te wekken met een frequentie van 10−7−10−9. Hiervan vertoonde het supernatant van tofu (een kaasachtig voedsel gemaakt van gestremde sojamelk) de hoogste activiteit (één in 10−7−10−8 ontvangende cellen), wat overeenkomt met ongeveer de helft van de efficiëntie die wordt verkregen met 100 mM CaCl2. Er waren echter geen duidelijke correlaties tussen transformatiefrequenties en chemische eigenschappen van de voedingsmiddelen (Ca2 + of Mg2 + concentraties en pH), wat suggereert dat complexe factoren binnen de voedingsmiddelen de competentieontwikkeling beïnvloeden. Vergelijkbare effecten van voedingsmiddelen bij het induceren van transformatie zijn gemeld bij E. coli (Bauer et al., 1999) en Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT in Biofilm met vaste lucht

Veel bacteriën komen voor als biofilms in natuurlijke en kunstmatige omgevingen (Davey en O’Toole, 2000). Biofilms zijn aggregaten van microben die zich vormen op de grensvlakken van vaste stof-vloeistof of vaste lucht (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Cellen in deze culturen met hoge dichtheid interageren met elkaar en vertonen onderscheidende fysiologische functies in vergelijking met hun vrije planktonische vormen. Eerdere studies naar E. coli-transformatie waren uitsluitend gericht op planktoncellen (Mandel en Higa, 1970; Hanahan, 1983), maar we toonden aan dat E. coli-cellen binnen SA-biofilms competentie ontwikkelen met een frequentie van 10−6−10−8 op verschillende vaste media, waaronder LB- en H2O-agar en verschillende vochtige voedingsmiddelen (Maeda et al., 2004). Levende cellen bestaan over het algemeen naast dode cellen in biofilms, en deze laatste kunnen hun DNA en bepaalde tweewaardige metaalionen, waaronder Ca2 + en Mn2 +, afgeven in de lokale micro-omgeving van de biofilm (Davey en O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Deze omstandigheden kunnen bevorderlijk zijn voor de ontwikkeling van transformatie en zijn mogelijk niet exclusief voor SA-biofilms, aangezien een vergelijkbare verbetering in E. coli lucht-vloeistofbiofilms ook is gerapporteerd (Król et al., 2011).

PT van wilde E. coli-stammen in water

De resultaten van onze en anderen suggereren dat E. coli uit de omgeving potentieel vreemd DNA kan verkrijgen via transformatie. Er zijn echter weinig eerdere rapporten van onderzoeken naar de transformeerbaarheid van natuurlijke E. coli-stammen (Woegerbauer et al., 2002; Sinha en Redfield, 2012). Daarom onderzochten we het potentieel van natuurlijke E. coli-stammen om competentie te ontwikkelen onder omgevingsomstandigheden. We gebruikten een standaard E. coli-verzameling van referentiestammen (ECOR) als ons model van natuurlijke E. coli (Ochman en Selander, 1984) omdat deze ECOR-stammen op grote schaal zijn gebruikt in verschillende onderzoeken naar de fysiologie, het gedrag en de genotypische variatie van natuurlijke E. coli (Tenaillon et al., 2010). We ontdekten dat sommige ECOR-stammen detecteerbare transformeerbaarheid (10−10−10−11) vertoonden in natuurlijk water (in de handel verkrijgbaar gebotteld natuurlijk zuiver water) bij constante en variërende temperaturen tussen 5 en 35 ° C en bij wintertemperaturen in een veldexperiment, wat suggereert dat natuurlijke E. coli potentieel competentie kan ontwikkelen onder bepaalde omstandigheden die mogelijk in het milieu kunnen voorkomen (Matsumoto et al., 2016b).

Horizontale plasmideoverdracht door transformatie in E. coli

Door bevriezing en dooi geïnduceerde HPTT in natuurlijke wateren en voedselextracten

In het milieu kan naakt DNA op natuurlijke wijze van dode cellen naar naburige cellen binnen dezelfde habitat of micro-omgeving worden gestuurd.Daarom is het de moeite waard om de mogelijkheid van HPTT in een gesloten systeem onder enkele haalbare omstandigheden te onderzoeken. Invriezen-ontdooien is een veelvoorkomend proces bij de omgang met voedingsmiddelen en komt ook voor in de natuur. Vries-dooi-behandeling van E. coli-cellen kan het lekken van DNA uit dode cellen en de daaropvolgende opname door overlevende cellen bevorderen, omdat ze reageren op hitteschok, wat resulteert in in situ transformatie (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Deze behandeling van gecondenseerde suspensies van gemengde E. coli-stammen in natuurlijk water en voedselextracten veroorzaakte in situ laterale overdracht van niet-conjugatieve plasmiden met een frequentie van 10 – 8 – 10 – 10 (Ishimoto et al., 2008). Dit fenomeen trad zelfs op na 1-2 maanden opslag bij -20 ° C en de gevoeligheid voor DNase toonde aan dat het werd gemedieerd via een transformatiemechanisme.

Lage frequentie van HPTT in SA Biofilms

Biofilms worden beschouwd als geschikte omgevingen voor in situ transformatie, omdat levende en dode cellen naast elkaar bestaan in de onmiddellijke nabijheid, en DNA dat vrijkomt uit dode cellen hoopt zich vaak op rond levende cellen. Bovendien, zoals hierboven beschreven, omdat E. coli-cellen een bescheiden competentie kunnen ontwikkelen in SA-biofilms (Maeda et al., 2004), dragen beide factoren bij aan HPTT in biofilms. Door simpelweg een plasmide-vrije stam samen te kweken met een die een niet-conjugatief plasmide herbergt in een SA-biofilm op antibioticavrije agarmedia, werden getransformeerde cellen binnen 24-48 uur met lage frequentie (10-9-10-10) geproduceerd. (Maeda et al., 2006). Vloeibare culturen van dezelfde stammen in LB-bouillon produceerden geen of weinig transformanten, wat het belang suggereert van SA-biofilmvorming voor plasmide-overdracht. In wezen deed hetzelfde fenomeen zich voor in SA-biofilms op voedselgebaseerde media (Ando et al., 2009). Dit fenomeen deed zich ook voor tussen populaire laboratoriumstammen zoals DH5, HB101 en MG1655 (Etchuuya et al., 2011), die lysogene faagvrij en conjugatief apparaatvrij zijn, wat suggereert dat de lage frequentie van horizontale plasmidenoverdracht in SA-biofilms kan optreden zonder de hulp van faag- of conjugatiemachines en daarom dat deze DNA-overdracht het gevolg is van een soort transformatie. Aangezien rpoS-mutatie deze HPTT echter niet beïnvloedde (Maeda et al., 2006), is het onwaarschijnlijk dat het RpoS-afhankelijke mechanisme (Zhang et al., 2012) hierbij betrokken is.

Hoge frequentie van HPTT Geïnduceerd door P1 Phage

Door combinaties van verschillende stammen en plasmiden te beoordelen voor horizontale plasmide-overdracht, bleek de E. coli-stam CAG18439 te werken als zowel een plasmide-donor als een plasmide-ontvanger in combinatie met het plasmide pHSG299 en kon het plasmide vaak in een gemengde celkweek overbrengen, zelfs in een vloeibaar medium (Etchuuya et al., 2011). Deze HGT bleek een type transformatie te zijn omdat de hoogfrequente plasmide-overdracht (10 – 5 – 10 – 8) DNase-gevoelig was. Verdere studies toonden aan dat dit fenomeen enkele specifieke kenmerken vertoont: (1) bevordering door proteïneachtige factor die vrijkomt uit CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) bevordering door een sequentie van 88 bp op pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) hoge overdrachtsfrequentie (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); en (4) afhankelijkheid van specifieke genen (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Met betrekking tot (1) onthulde een latere studie dat deze eiwitachtige factoren een P1vir-faagdeeltje (of een derivaat daarvan) omvatten en dat extern toegevoegde P1vir-faag horizontale plasmidenoverdracht tussen E. coli-cellen en de drie andere belangrijke kenmerken van CAG18439 kan reproduceren. -afhankelijke HPTT (Sugiura et al., 2017). Dit fenomeen was ook grotendeels DNase-gevoelig, wat suggereert dat een groot deel van deze plasmide-overdracht het gevolg is van transformatie ondanks de betrokkenheid van P1-faag. Het transformatiemechanisme van door P1vir-faag geïnduceerde plasmide-overdracht kan het gevolg zijn van faaginfectie of spontaan ontwaken van gelyogeniseerde faag in cellen die plasmiden herbergen, wat leidt tot cellysis en daaropvolgende intracellulaire afgifte van plasmide-DNA in een bruikbare vorm voor transformatie. Hoewel een dergelijk mechanisme over het algemeen haalbaar is, zijn er weinig duidelijke demonstraties van geweest in E. coli. Een recente studie van Keen et al. (2017) met behulp van een ander faagsysteem toonde ook een vergelijkbaar faag-geïnduceerd transformatiemechanisme in E. coli. HPTT door P1vir of CAG18439 kan echter niet adequaat worden verklaard alleen door verbeterde DNA-toevoer van door faag geïnduceerde cellysis, en het verschilt van eenvoudige transformatie in E. coli (Hanahan, 1983) in termen van zijn onderscheidende kenmerken (2–4). Met betrekking tot (2) is de sequentie van 88 bp op pHSG299 niet homoloog met het deel van de genoomsequentie van de P1-faag. Deze sequentie wordt vaak gevonden in databases onder algemene kloneringsvectorsequenties, maar niet in een natuurlijke bron. Door het constructieproces van pHSG299 te herleiden (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), vermoeden we echter dat de sequentie van 88 bp afkomstig is van R6-5, een conjugatief R-plasmide.Deze sequentie en vergelijkbare DNA-elementen kunnen bijdragen aan HPTT van R en andere plasmiden in de omgeving. Met betrekking tot (3) kan deze hoogfrequente overdracht niet worden verklaard door het eenvoudige PT-vermogen van CAG18439 en andere gebruikte stammen, omdat eenvoudige PT in die stammen onder de equivalente kweekomstandigheden 105-102 keer minder frequent was (Etchuuya et al., 2011). Daarom werd gesuggereerd dat een CAG18439-afgeleide eiwitfactor, met een geschatte grootte tussen 9 en 30 kDa (Etchuuya et al., 2011), ook zou kunnen worden betrokken bij het bevorderen van HPTT. Deze factor helpt vermoedelijk bij de opname van DNA door ontvangende cellen, waarschijnlijk in combinatie met de sequentie van 88 bp op het transformerende DNA. Ten slotte, met betrekking tot (4), suggereerden latere genoombrede screeningstudies voor ontvangende genen die betrokken zijn bij HPTT dat meerdere genen deelnemen aan het mechanisme (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Deze omvatten die waarvan niet is gemeld dat ze betrokken zijn bij natuurlijke of kunstmatige transformatie in E. coli (zoals rodZ) en een paar bekende homologen van competentiegen, zoals ybaV en yhiR (Finkel en Kolter, 2001; Palchevskiy en Finkel, 2006 ), maar omvatten geen rpoS en andere genen die verband houden met het RpoS-afhankelijke mechanisme (Zhang et al., 2012). Over het algemeen wijzen deze resultaten op een onbekend, complex mechanisme van door faag geïnduceerde, hoogfrequente HPTT die gedeeltelijk de route van natuurlijke transformatie deelt.

HPTT tussen natuurlijke E. coli-stammen

Om de algemeenheid en verscheidenheid van HPTT in E. coli-stammen verder te beoordelen, werden natuurlijke stammen (de eerder genoemde ECOR-stammen) gebruikt in een onderzoek naar HPTT. Verschillende combinaties van ECOR-stammen werden samen gekweekt in vloeibare media, wat resulteerde in DNase-gevoelige horizontale overdracht van natuurlijke antibioticumresistentiegenen (Matsumoto et al., 2016a, b). Plasmide-isolatie van deze nieuwe transformanten toonde horizontale plasmide-overdracht tussen ECOR-stammen aan (Matsumoto et al., 2016a, b). Eenvoudige PT-experimenten met dezelfde ECOR-stammen onthulden dat HPTT veel vaker voorkomt (10-6-10-8) dan eenvoudige PT (minder dan 10-10) onder dezelfde kweekomstandigheden, wat suggereerde dat HPTT uniek en effectief is. Bovendien ontdekten we dat 6 van de 12 combinaties van de ECOR-stammen, waarvan sommige geen plaque-vormende fagen produceren (Shibata et al., 2014b), DNase-gevoelige genoverdracht vertoonden, wat ons doet vermoeden dat HPTT vrij algemeen voorkomt in natuurlijke E. coli-stammen. Al met al suggereren deze gegevens dat sommige faag- en conjugatie-vrije transformatiemechanismen ook van nature voorkomen in sommige E. coli-stammen en dat HPTT van antibioticaresistente natuurlijke plasmiden (zoals plasmiden van de ECOR24-stam: toegangsnummers AB905284 en AB905285) kan een route zijn voor het produceren van multiresistente natuurlijke E. coli-cellen.

Mogelijke mechanismen en haalbaarheid van PT en HPTT in E. coli in het milieu

Voorbeelden van PT en door bevriezing-dooi geïnduceerde en laagfrequente HPTT die in deze mini-review zijn geïntroduceerd, zijn waarschijnlijk meer gerelateerd aan het poriënvormende mechanisme dan aan het competentiegenafhankelijke mechanisme, omdat voedingsmiddelen en natuurlijk water vaak mM-niveaus van Ca2 + en Mg2 + -ionen bevatten (Baur et al. al., 1996; Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), en de biofilmomgeving voorziet levende cellen van de inhoud van dode cellen, waaronder divalente metaalionen en transformeerbaar plasmide-DNA. Zoals we eerder hebben beschreven (Maeda et al., 2006), bevat een SA-biofilm (diameter 10-12 mm; dikte 0,5-0,8 mm) ongeveer 2-5 × 109 cellen. Bovendien bedragen de darmbacteriën bij zoogdieren in het algemeen ongeveer 1011 cellen / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Gezien de enorme omvang van de omgeving, kunnen zelfs transformatiefrequenties van 10−9−10−10 niet worden onderschat, aangezien ze een impact zullen hebben op de bacteriepopulaties.

Hoogfrequente HPTT die in dit artikel wordt beschreven, kan betrekking hebben op niet alleen het porievormende mechanisme, maar ook een deel van de competentiegenfuncties en mogelijk een ander onbekend mechanisme, zoals hierboven vermeld. Omdat bacteriofagen een van de meest voorkomende organismen in de biosfeer zijn en alomtegenwoordig in de omgeving (Clokie et al., 2011), wordt faag-geïnduceerde HPTT ook als haalbaar beschouwd in het milieu, evenals gewone transductie en andere van faag afkomstige manieren van HGT, bijv. genoverdrachtsmiddelen (Lang et al., 2012).

Conclusie en perspectief

Over het algemeen geven onze resultaten en gerelateerde eerdere gegevens aan dat meerdere mechanismen transformatie- type HGT in E. coli gebaseerd op verschillende omgevings- en cellulaire omstandigheden, zoals de aard van de media (bijv. water en voedsel), variabele temperatuur van onder nul tot ∼40 ° C, hoge celdichtheid in biofilms en verschillende genetische achtergronden van de betrokken stammen. De bijdrage van transformatie-type HGT aan de genetische dynamiek in het milieu kan worden onderschat (Bushman, 2002; Thomas en Nielsen, 2005), en onze studies geven aan dat HPTT in E.coli treedt op bij aanzienlijke overdrachtsfrequenties (10 – 5 – 10 – 10) onder de omstandigheden die mogelijk in de omgeving kunnen worden aangetroffen. Daarom kan HGT van het transformatietype bijdragen aan de verspreiding van antibioticaresistentie-genen en de opkomst van multiresistente bacteriën in de echte omgeving buiten laboratoria. Verdere studies zijn nodig om de precieze rol en bijdrage van transformatie-type HGT bij het verspreiden van antibioticaresistentie te begrijpen.

Bijdragen van de auteur

HH, ES en SM schreven het artikel.

Financiering

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Verklaring inzake belangenconflicten

De auteurs verklaren dat het onderzoek uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een mogelijk belangenconflict.

Dankbetuigingen

We zijn Enago (www.enago.jp) dankbaar voor het Engels redactie- en proefleesservices.