Experimentele methode

Net zoals de formule die wordt gebruikt om de signaal-ruisverhouding te berekenen, een dramatisch effect kan hebben op de de schijnbare gevoeligheid van een bepaalde spectrale dataset, de hardwareconfiguratie van het instrument en de experimentele parameters van de data-acquisitie hebben ook een dramatisch effect op de kwaliteit van het verkregen spectrum.

Er zijn veel hardwareparameters, instellingen en opties die allemaal van invloed zijn op de gemeten gevoeligheid van een spectrofluorometer. Dit kan het buitengewoon moeilijk maken om de relatieve gevoeligheid van twee verschillende instrumenten absoluut te vergelijken, als ze niet op vrijwel identieke manier worden gebruikt. Hieronder bespreken we elk van deze factoren en de impact die ze hebben op de resulterende data.

Van toepassing op alle scanfluorometers

Excitatiegolflengte: de excitatiegolflengte moet identiek zijn voor alle systemen die worden vergeleken. De HORIBA-methode gebruikt 350 nm excitatie voor de Raman-band van water, net als de meeste andere fabrikanten. Bij opwinding bij 350 nm heeft de Raman-emissieband voor water een piek bij 397 nm.

Het is een geluk dat de meeste fabrikanten hebben gestandaardiseerd op deze excitatiegolflengte, omdat dit een betere vergelijking mogelijk maakt. Het is echter volkomen geldig om de excitatiegolflengte naar een andere waarde te verplaatsen als een manier om de gevoeligheid in een ander golflengtebereik te testen (bijv. De NIR).

Emissiescanningbereik: de HORIBA-methode scant de emissiemonochromator van 365 tot 450 nm, met stappen van 0,5 nm, om de volledige Raman-piek bij 397 nm en ook de achtergrond bij 450 nm te verzamelen.

Bandbreedte (spleetgrootte): de HORIBA-methode gebruikt een bandbreedte van 5 nm spleten op zowel de excitatie- als de emissiespectrometers. Sommige fabrikanten specificeren sleuven van 10 nm, wat het effect heeft dat de gevoeligheid toeneemt in vergelijking met 5 nm. Er is gemeld dat het verdubbelen van de fysieke spleetgrootte bij de in- en uitgang van een monochromator de intensiteit van excitatie en de emissiedetectiedoorvoer kan verviervoudigen, aangezien de verwerkingscapaciteit gaat als het kwadraat van de grootte toeneemt, maar dit is een simplistische schatting die moet worden gemeten empirisch. HORIBA heeft het factorverschil met de HORIBA Fluoromax gemeten en waargenomen dat voor Fluoromax het verdubbelen van de spleten van 5 naar 10 nm de algehele signaal-ruisverhouding voor de Raman-band van water met een factor meer dan 3 keer verhoogt. Dit zal echter voor alle fluorometers verschillen, dus vergelijk deze niet met identieke bandpassages.

Integratietijd (of reactietijd): dit verwijst naar hoe lang de detector een signaal mag verzamelen bij een bepaald golflengte stap positie. Het speelt ook een belangrijke rol bij de algehele gevoeligheid die wordt gemeten voor een fluorometer. De HORIBA-methode gebruikt een integratietijd van 1 seconde op elk golflengtepunt, vergelijkbaar met andere fabrikanten. Sommige fabrikanten specificeren echter een responstijd van 2 seconden, waardoor de algehele signaal-ruisverhouding met bijna een factor twee toeneemt. Zorg ervoor dat u dezelfde integratie- (respons) tijd gebruikt bij het vergelijken.

PMT-type: de meeste spectrofluorometers gebruiken een fotomultiplicatorbuis (PMT) als hun enige detector van fluorescentie-emissie, zonder enige optie voor het vervangen van de detectorbehuizing. Dit geldt voor de meeste tafelmodel analytische fluorometers. Sommige van deze tafelmodel systemen maken de selectie mogelijk van verschillende individuele PMT’s met verschillende golflengtebereiken en specificaties. PMT’s die niet zo ver in de NIR detecteren als andere PMT’s, hebben een lager aantal donker, zodat ze een betere signaal-ruisverhouding bieden in het bereik van 350 tot 400 nm, maar ze zijn mogelijk niet bruikbaar in de gehele emissiegolflengte bereik gewenst voor een bepaald laboratorium. De standaard PMT van HORIBA die wordt gebruikt in de FluoroMax Plus, Fluorolog3 en QuantaMaster 8000 series fluorometers, is de Hamamatsu R928P PMT, die wordt beschouwd als de industriestandaard voor fluorometer. Zorg er in deze gevallen voor dat elke fluorometer waar mogelijk dezelfde PMT gebruikt.

Optische filters: een optisch filter kan worden toegevoegd aan het optische pad van een fluorometer, zowel aan de excitatiekant als aan de emissiekant. van de steekproef. Deze kunnen handmatig in een filterhouder in het monstercompartiment worden geplaatst, of ze kunnen deel uitmaken van een filterwiel dat automatisch verschillende filters in het optische pad kan plaatsen wanneer verschillende experimentele protocollen worden geselecteerd. Optische filters hebben het effect dat ze de onderdrukking van strooilicht bij bepaalde golflengten verbeteren, en ze kunnen de signaal-ruisverhouding van een fluorometer aanzienlijk verbeteren. HORIBA gebruikt geen optische filters, behalve de scanspectrometers zelf, bij het specificeren van de SNR voor water Raman met de specificaties van de Fluoromax, Fluorolog3 of QuantaMaster 8000 serie.Wanneer u een HORIBA-fluorometer vergelijkt met een fluorometer die automatische filters gebruikt, gebruik dan geen filter, of als het automatisch is, controleer dan welk merk en type filters worden gebruikt en waar ze worden gebruikt, om een vergelijkbare experimentele methode te repliceren met een HORIBA-fluorometer.

Van toepassing op modulaire onderzoeksfluorometers

Detectortype: modulaire onderzoeksfluorometers zijn standaard voorzien van een PMT-behuizing, maar maken veel verschillende typen enkelkanaals detectoren mogelijk om de golflengte te verlengen bereik of fluorescentie levensduur van een instrument. Alternatieve detectoren zijn onder meer gekoelde PMT-behuizingen, verschillende solid-state detectoren zoals InGaAs, MCP PMT’s enzovoort. Deze verschillende soorten detectoren zullen dramatische effecten hebben op de signaal-ruisverhouding van een bepaalde monstermeting, dus ook hier, als je de gevoeligheid van de ene fluorometer met de andere probeert te vergelijken, zorg er dan voor dat hetzelfde detectortype wordt gebruikt om gegevens te verzamelen over beide systemen.

Detectortemperatuur: de meeste commerciële spectrofluorometers gebruiken PMT-behuizingen die niet worden gekoeld, en in feite bieden veel instrumenten zelfs geen gekoelde detectoroptie. Een gekoelde PMT-behuizing kan de gevoeligheid van een instrument verbeteren door de donkere tellingen (achtergrond) te verminderen in vergelijking met dezelfde exacte PMT in een omgevingsbehuizing. De standaard PMT-behuizingen van HORIBA in de FluoroMaxPlus, Fluorolog3 en QuantaMaster 8000 zijn PMT-behuizingen voor omgevingstemperatuur, maar de Fluorolog3- en QuantaMaster 8000-serie bieden optionele gekoelde PMT-behuizingen om de gevoeligheid en NIR-detectie te verbeteren. Zorg er bij het vergelijken van modulaire onderzoeksfluorometers voor dat de gegevens die zijn verzameld met hetzelfde type PMT-behuizing (omgevingstemperatuur of gekoeld) worden vergeleken, en indien gekoeld, ook gekoeld tot dezelfde temperatuur.

Enkele versus dubbele monochromator: modulair Onderzoeksfluorometers stellen een onderzoeker in staat om enkele of dubbele monochromatoren te selecteren op het optische pad van excitatie of emissie. Hier verwijst de term dubbele monochromator naar twee verspreide roostertrappen, de een na de ander, met een ingangsspleet, tussenliggende gleuf en een uitgangsspleet. Een dubbele monochromator kan worden geconfigureerd in de additieve of dispersieve modus, maar in beide gevallen zijn de doorvoer- en strooilichtkarakteristieken van een enkele versus een dubbele monochromator enorm verschillend en zullen ze een grote impact hebben op de SNR van een Raman-scan op water, zelfs als de bandbreedtes, integratietijden en golflengten allemaal constant worden gehouden.

Groefdichtheid van rooster: De groefdichtheid van een rooster heeft ook invloed op de doorvoer en dus de gevoeligheid van een spectrofluorometer. Voor de meeste spectrofluorometers is dit niet zo’n groot probleem, omdat de systemen zijn vervaardigd met slechts één bepaald rooster. In dit geval is het belangrijkste om ervoor te zorgen dat de bandpasses hetzelfde zijn. Voor modulaire fluorometers kunt u de monochromatoren echter configureren met verschillende roosters of meerdere roosters. Bij deze systemen moet u heel voorzichtig zijn om de zaken zo veel mogelijk op elkaar te laten lijken. Als u bijvoorbeeld twee instrumenten hebt met vergelijkbare brandpuntsafstandspectrometers, zal het veranderen van de groefdichtheid van het rooster de gevoeligheid voor dezelfde 5 nm banddoorlaatinstelling vergroten of verkleinen. De HORIBA-methode maakt gebruik van roosters met een groefdichtheid van 1.200 groeven per millimeter.

Blaze-hoek van rooster: de roosters die zijn geselecteerd voor een excitatie- of emissiemonochromator zorgen voor een optimale doorvoer bij een bepaalde golflengteband, ook wel de blaze genoemd. hoek, aangezien deze wordt bepaald door de hoek van de roosteretsing die op het roosteroppervlak wordt uitgeoefend. Als zodanig zou een excitatiemonochromator met een 350 nm uitlopende excitatiemonochromator en een 400 nm emissiemonochromator optimale keuzes zijn om de beste Raman-gevoeligheid voor water te bereiken bij excitatie bij 350 nm. Aangezien de meeste fluorometers u niet toestaan het rooster aan te passen, is deze variabele geen factor, maar voor degenen die u wel roosters laten kiezen, moet u roosters kiezen met dezelfde of zeer vergelijkbare vuurhoek om een geldige vergelijking te maken. .