Recente vorderingen in p53-onderzoek en kankerbehandeling
Samenvatting
TP53, dat codeert voor p53, is een van de beroemdste tumoronderdrukkingsgenen. De meeste kankers bij mensen tonen de inactivering van de p53-route aan. Mutant p53 functioneert niet alleen niet langer als een tumoronderdrukker, maar kan ook tumorbevorderende effecten uitoefenen. De basisfunctie van p53 is om te reageren op cellulaire stress. We bespreken hierin de recente vorderingen in p53-onderzoek en concentreren ons op apoptose, celcyclusstilstand en veroudering als reactie op stress. We bespreken ook de klinische toepassingen van op p53 gebaseerde therapie voor kanker bij de mens.
1. Inleiding
Het TP53-gen, dat codeert voor p53, is een van de meest frequent gemuteerde genen bij menselijke kankers. Er wordt gemeld dat ongeveer de helft van alle kankers p53 heeft geïnactiveerd. Het p53-eiwit heeft een breed scala aan biologische functies, waaronder regulering van de celcyclus, apoptose, veroudering, DNA-metabolisme, angiogenese, celdifferentiatie en de immuunrespons. Talrijke publicaties hebben verschillende functies van p53 gerapporteerd, waaronder transcriptionele, posttranscriptionele en posttranslationele rollen.
In dit artikel zullen we ons concentreren op kwesties met betrekking tot p53 en de toepassing van op p53 gebaseerde kankertherapieën. Zoals beoordeeld door Vousden en Prives, zijn de belangrijkste functies van p53 de regulering van groeistop en apoptose.
2. Normale functies van p53
Talrijke studies hebben aangetoond dat p53 een transcriptiefactor is die zich richt op vele genen en microRNA’s als reactie op stress in de kelder. De sleutelrol van p53 als een tumoronderdrukker is om de voortgang van de celcyclus te blokkeren en / of om apoptose te induceren als reactie op cellulaire spanningen zoals DNA-schade. Verminderde p53-activiteit bevordert de accumulatie van DNA-schade in cellen, wat leidt tot een kankerfenotype. Als transcriptiefactor vormt p53 een divers en complex genregulerend netwerk. Er is uitgebreid onderzoek gedaan naar de doelsequenties die p53 herkent, het p53-responselement (RE), zoals onlangs besproken door Riley et al. p53 heeft een zeer breed scala aan biologische activiteiten, dus deze review zal zich richten op de rol van p53 als tumoronderdrukker en de implicaties ervan voor kankertherapie.
2.1. Humane kankers en p53-mutaties
De frequentie van TP53-mutaties varieert van ~ 10% (hematopoëtische maligniteiten) tot 50-70% (ovariële, colorectale en hoofd-hals maligniteiten). Kiembaanmutatie van TP53 veroorzaakt het Li-Fraumeni-syndroom, een familiair kankersyndroom waaronder borstkanker, wekedelensarcoom en verschillende andere soorten kanker. De meeste TP53-mutaties bij menselijke kankers resulteren in mutaties binnen het DNA-bindende domein, waardoor wordt voorkomen dat p53 zijn doelwitgenen transcribeert. Mutant p53 heeft echter niet alleen geleid tot een verlies van de normale functie van het wildtype eiwit, maar ook tot nieuwe mogelijkheden om kanker te bevorderen. Het eerste rapport van deze functiewinst door mutant p53 was de waarneming dat transfectie van mutant p53 in p53-nulcellen de tumorvorming bij muizen verbetert. Talrijke vervolgstudies hebben deze bevinding bevestigd.
2.2. p53 als een tumoronderdrukker
2.2.1. p53 als een sensor van DNA-schade
Genetische instabiliteit is een van de meest prominente kenmerken van kwaadaardige tumoren. Er zijn zeer geavanceerde systemen om DNA-schade op te sporen en het genoom te repareren. p53 speelt een belangrijke rol in dergelijke “verzorgende” systemen. Wanneer p53 reageert op DNA-schade, lokt het ofwel celcyclusstop ofwel apoptose uit.
In 1991 werd aangetoond dat inductie van wildtype p53 apoptose kan induceren in leukemiecellen.Muizen die een specifieke p53-mutant hebben, missen het vermogen om celcyclusstilstand te induceren, maar behouden het vermogen om apoptose te induceren, waardoor ze oncogen-geïnduceerde tumoren efficiënt kunnen onderdrukken, wat suggereert dat de pro-apoptotische functie van p53 mogelijk een meer belangrijke rol in zijn antitumoreffecten dan in zijn inductie van celcyclusstop.
2.2.2. p53 en apoptose
Talrijke rapporten hebben het mechanisme beschreven waarmee p53 apoptose induceert. Zoals p53 voornamelijk functioneert als een transcriptiefactor, is het belangrijk om de genen te onderzoeken die worden gereguleerd door p53 die bijdragen aan de regulatie van apoptose. Vroege studies toonden aan dat wild-type p53 kan binden aan de bax-genpromotorregio en bax-gentranscriptie kan reguleren. bax is een lid van de Bc l-2-familie, die heterodimeren vormt met Bcl-2 en de activiteit ervan remt. De Bcl-2-eiwitfamilie speelt een belangrijke rol bij apoptose en kanker. Bcl-2 regelt bijvoorbeeld de afgifte van cytochroom c uit de mitochondriën, dat de apoptotische route activeert door caspase 9 te activeren. Caspase 9 activeert vervolgens de beul caspase 3. Beide caspasen spelen een sleutelrol in de apoptotische route.
Verschillende menselijke kankers, waaronder darm- en maagkanker, hebben de expressie van Bcl-2 veranderd. Het belang van het expressieniveau van Bcl-2 voor de prognose van kankerpatiënten wordt echter nog onderzocht.De bijdrage van bax-expressie aan de prognose van kankerpatiënten en de respons op therapie is ook onduidelijk. Bij borstkanker toonde een onderzoek aan dat een lage expressie van bax geassocieerd is met een slechte prognose, terwijl andere rapporten geen verband hebben aangetoond tussen het expressieniveau van bax en de prognose. Verder onderzoek zal daarom nodig zijn.
CD95 (ook wel Fas en Apo-1 genoemd) is een ‘doodsreceptor’ wat aangeeft dat het een belangrijke rol speelt bij apoptose. Het eerste rapport van CD95 toonde aan dat een anti-CD95-antilichaam verminderde de groei van humane B-cel xenotransplantaattumoren. Sindsdien zijn er talrijke rapporten gepubliceerd over de door CD95 geïnduceerde signaalroute bij apoptose. Cytotoxische middelen, zoals chemotherapeutische geneesmiddelen, kunnen apoptose induceren in geneesmiddelgevoelige cellen. Het is daarom belangrijk om verduidelijk welke signaalroute (s) het meest bijdraagt aan apoptose. Het verduidelijken van deze informatie zou nuttig zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen.
Verschillende rapporten hebben aangegeven dat de CD95-route een belangrijke rol speelt bij apoptose geïnduceerd door cytotoxische middelen, en dat dit systeem omvat de activering van wild-type p53. Daarom kan de p53-status de chemogevoeligheid beïnvloeden via CD95-signalering. Een recent rapport gaf echter aan dat CD95 tumorgroei zou kunnen bevorderen. Geprogrammeerde celdood is erg gecompliceerd d en hangt af van verschillende factoren.
Er bestaat een Bcl-2-subfamilie die alleen het BH3-domein bevat. Er zijn verschillende BH3-eiwitten geïdentificeerd en p53 fungeert als een transcriptiefactor voor PUMA en NOXA, die beide tot deze klasse behoren. PUMA is ook een belangrijke mediator van de apoptotische route geïnduceerd door p53.
Wanneer PUMA wordt verstoord in karteldarmkankercellen, wordt p53-geïnduceerde apoptose voorkomen. PUMA kan een cruciale rol spelen bij het bepalen van het lot van de cel (geprogrammeerde celdood versus celcyclusstop) als reactie op p53-activering. Een rapport over PUMA-knock-outmuizen toonde aan dat knock-out van PUMA de apoptotische deficiëntie weergeeft die werd waargenomen bij p53-knock-outmuizen. PUMA is een essentiële bemiddelaar voor p53-afhankelijke en -onafhankelijke apoptose in vivo. Omdat het ontwijken van apoptose een van de kenmerken van kanker is, kan PUMA ook een belangrijke rol spelen tijdens carcinogenese.
Recente rapporten hebben echter aangetoond dat apoptose in bepaalde situaties carcinogenese kan bevorderen. Michalak et al. en Labi et al. toonde aan dat het verlies van PUMA de door gammastraling geïnduceerde thymuslymfomagenese deed verdwijnen. PUMA-deficiënte hematopoëtische stamcellen worden beschermd tegen door gammastraling geïnduceerde celdood, wat compenserende proliferatie en replicatie vermindert. Aan de andere kant ondergaan wildtype muizen massale celdood wanneer ze gammastraling kregen, wat vervolgens leidde tot herbevolking van de regio door stam- / voorlopercellen. Deze rapporten geven aan dat de homeostase stam / voorlopercellenstructuur van weefsel tumorvorming kan onderdrukken. Dit fenomeen moet worden bevestigd, maar er moet rekening mee worden gehouden bij de behandeling van patiënten met strategieën zoals chemotherapie en / of bestraling.
2.2.3. p53 en celcyclusstilstand
Het p53-eiwit onderdrukt de tumorvorming niet alleen door apoptose te induceren, maar ook door celcyclusstilstand te veroorzaken. Afhankelijk van het type cellulaire stress kan p53 G1-arrestatie induceren door activering van transcriptie van de cycline-afhankelijke kinaseremmer p21. Dit proces is algemeen bekend en is uitgebreid bestudeerd. p53 regelt ook de G2 / M-overgang. P53 kan bijvoorbeeld het binnendringen van cellen in mitose blokkeren door remming van Cdc2. Cdc2 moet binden aan cycline B1 om te kunnen functioneren. Onderdrukking van cycline B1 door p53 ook arrestaties van cellen in G2. Het is echter mogelijk dat een voorbijgaande celcyclus niet leidt tot uitroeiing van de tumor, omdat een cel met oncogeen potentieel die niet kan worden hersteld, de proliferatie kan hervatten.
Daarom kan het andere mechanisme, cellulaire veroudering, een belangrijke rol spelen bij p53- gemedieerde tumoronderdrukking. Cellulaire veroudering is een permanente stopzetting van de celcyclus. Er zijn veel rapporten over de correlatie tussen tumorontwikkeling, p53 en veroudering. We zullen enkele van deze factoren bespreken vanuit het standpunt van kankertherapie. Oncogeen ras dat tot expressie wordt gebracht in primaire cellen van mensen en knaagdieren, resulteert in cellulaire veroudering. Dit proces is te wijten aan de accumulatie van p53 en p16. Inactivering van p53 of p16 voorkomt ras-geïnduceerde veroudering. Dit rapport suggereert dat kelderveroudering een belangrijke rol speelt bij het onderdrukken van tumorontwikkeling. De inactivering van p53, zoals aanwezig is in de meeste menselijke kankers, stelt cellen in staat veroudering van de kelder te omzeilen, wat resulteert in de ontwikkeling van tumoren op macroniveau.
p53 lijkt ook te voorkomen dat premaligne laesies zich ontwikkelen tot kwaadaardige tumoren door senescentieprogramma’s te activeren . Cellulaire veroudering geïnduceerd door p53 is niet alleen belangrijk voor kankerpreventie, maar ook voor het antikankereffect dat wordt geïnduceerd door wild-type p53 dat in gevestigde tumoren wordt geïntroduceerd.
Xue et al. construeerde een muismodel van leverkanker met voorwaardelijk gereguleerd endogeen p53.Reactivering van endogeen p53 in p53-deficiënte tumoren resulteert in volledige tumorregressie. Interessant genoeg was de primaire reactie op p53 niet apoptose, maar de inductie van een kelderverouderingsprogramma. Dit programma veroorzaakte een aangeboren immuunrespons die de tumor uit de gastheer verdreef.
We hebben twee belangrijke rollen van p53 als tumoronderdrukker besproken. Onder de verschillende functies van p53 zijn apoptose en senescentie de belangrijkste mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de onderdrukking van tumoren. Hoe p53 precies bepaalt of de activering van het senescentieprogramma of het apoptoseprogramma al dan niet plaatsvindt, moet echter nog worden opgehelderd. Deze vraag is vooral belangrijk voor de ontwikkeling van op p53 gebaseerde kankertherapie, inclusief benaderingen in combinatie met conventionele chemotherapie. De meeste conventionele chemotherapeutische middelen elimineren kankercellen door ze te doden. Daarom, als p53 veroudering induceert in plaats van apoptose, zal er een conflict ontstaan. Er is inderdaad gemeld dat sommige soorten borstkanker door endogene p53 worden beschermd tegen cytotoxische chemotherapeutische middelen.
Daarom zijn er meerdere factoren, zoals de kwaliteit en kwantiteit van cellulaire stress, het weefseltype en de kelder micro-omgeving, bepaal het lot van de cel. Vousden en Prives stelden een model voor waarin de beslissing tussen leven en dood kan worden bepaald door de omvang van de schade of de duur van stress. In hun model lokt een laag stressniveau dat kan worden gerepareerd een DNA-herstel- / overlevingsreactie uit, terwijl een hoog niveau van stress dat niet kan worden hersteld een apoptotische of verouderingsreactie induceert. Deze tweeledige aard van p53, killer en beschermer, duidt op de mogelijkheid dat p53 ook als tumorpromotor kan werken. De anti-apoptotische functie van p53 kan leiden tot de overleving van beschadigde cellen, wat de kans op kwaadaardige transformatie kan vergroten (Figuur 1).
2.3. Toepassingen van op p53 gebaseerde kankertherapie
Omdat de meeste, zo niet alle, menselijke kankers veranderde p53 herbergen, is het concept van herstel van p53 voor kankertherapie erg aantrekkelijk. Een diermodel toonde aan dat de reactivering van wildtype p53 resulteert in efficiënte tumorregressie, inclusief regressie van lymfoom en levercarcinoom.
2.3.1. Mutant p53 reactiveren
Er is een klasse van kleine moleculen die de wild-type functies van mutant p53 reactiveren. PhiKan083 is een carbazoolderivaat dat wordt gevonden uit in silico-screening van de kristalstructuur van p53. Door gemuteerd p53 te binden, verhoogt PhiKan083 de smelttemperatuur van gemuteerd p53, wat resulteert in de reactivering van zijn functie. PRIMA-1 is een ander klein molecuul geïdentificeerd door celgebaseerde screening die sequentiespecifieke DNA-binding en de actieve conformatie van p53 herstelde. CP-31398 is ook een klein molecuul dat de eiwitvouwing van gemuteerd p53 kan herstellen tot een meer natuurlijke conformatie die een wild-type functie mogelijk maakt.
2.3.2. p53-stabilisatie
MDM2 is een E3-ubiquitine-ligase die de afbraak van p53 regelt. Veel tumoren brengen MDM2 tot overexpressie, zelfs tumoren zonder p53-mutaties. Het richten op MDM2 voor p53-stabilisatie lijkt veelbelovend, dus er zijn veel rapporten over het richten op MDM2 of de MDM2-p53 gepubliceerd.
De nutlinen zijn bijvoorbeeld cis-imidazolineverbindingen die fungeren als antagonisten van de MDM2- p53 interactie. Analyse van de kristalstructuur toonde aan dat nutlin bindt in de pocket van MDM2 om de p53-MDM2-interactie te voorkomen. Nutlin kan de p53-route activeren, waardoor kankercellen en xenotransplantaattumoren bij muizen de celcyclusstilstand, apoptose en groeiremming ondergaan.
MI-219 is een ander klein molecuul dat de MDM2-p53-interactie remt. MI-219 activeert ook de p53-route in cellen met wildtype p53. Apoptose en stopzetting van de celcyclus werden waargenomen in xenotransplantaattumoren, wat resulteerde in tumorregressie.
MDM2-remming en p53-activering in normaal weefsel kunnen echter schadelijk zijn. Ringshausen et al. toonde aan dat p53 spontaan wordt geactiveerd in veel weefsels in MDM2-deficiënte muizen.Bovendien veroorzaakte p53 fatale pathologieën, waaronder de ablatie van klassiek radiosensitieve weefsels.
2.3.3. Andere klassen van geneesmiddelen voor p53-stabilisatie
Tenovin werd gevonden door een celgebaseerde medicijnscreening om p53 te activeren. Tenovin werkt als een remmer van de proteïne-deacetylerende activiteiten van SirT1 en SirT2. Het is aangetoond dat de intraperitoneale toediening van tenovin-6 een regressie van xenotransplantaattumoren induceert in een muismodus.
Issaeva et al. onderzocht een chemische bibliotheek en vond het kleine molecuul RITA (reactivering van p53 en inductie van tumorcelapoptose), dat bindt aan p53 en de p53-MDM2-interactie zowel in vitro als in vivo remt. RITA induceerde apoptose in verschillende kankercellen die wildtype p53 behielden. Ze ontdekten ook dat de p53 die door RITA uit MDM2 wordt vrijgegeven, p21 en hnRNP K (een p53-cofactor) bevordert, wat impliceert dat p21 een belangrijke rol speelt bij het reguleren van het lot van kankercellen na p53-reactivering (Figuur 2).
2.4. p53 Remming voor kankertherapie
De remming van p53 kan normale cellen beschermen tijdens genotoxische chemotherapie of bestralingstherapie. De bijwerkingen van genotoxische therapie voor kanker worden grotendeels veroorzaakt door p53-gemedieerde apoptose. Het kleine molecuul pifithrine-alfa kan p53-afhankelijke transcriptionele activiteit blokkeren en muizen beschermen tegen de dodelijke bijwerkingen die gepaard gaan met antikankerbehandeling. Als we dosisbeperkende genotoxische stress voor normale cellen tijdens chemotherapie of radiotherapie voor kanker kunnen vermijden, kan een hogere dosis worden gebruikt voor patiënten die niet voldoende reageren op conventionele chemotherapie.
2.5. p53 Gentherapie
De eerste op p53 gebaseerde gentherapie werd gerapporteerd in 1996. Een retrovirale vector met het wild-type p53-gen onder de controle van een actinepromotor werd direct geïnjecteerd in tumoren van niet-kleine cel-longkankerpatiënten . Na de ontwikkeling van een replicatiedefect recombinant p53-virus (Ad5CMV-p53), zijn veel klinische onderzoeken uitgevoerd, waaronder een bij slokdarmkankerpatiënten. Enkele onderzoeken bereikten fase III, maar de definitieve goedkeuring van de FDA is nog niet verleend. Recentelijk heeft zich in China gentherapie op basis van p53 ontwikkeld.
2.6. p53-gebaseerde immunotherapie
Tumorgeassocieerde antigeenspecifieke cytotoxische T-lymfocyt kan de immuunrespons van de gastheer tegen kanker in vivo mediëren. P53-eiwit, vooral gericht op missense-mutatie van p53, kan kandidaat zijn voor tumorantigeen. Sommige kankerpatiënten hebben antistoffen tegen p53, de frequentie en de klinische betekenis staan nog ter discussie.
Speetjens et al. gerapporteerde klinische onderzoeken met een p53-specifiek synthetisch lang peptide (p53-SLP) -vaccin voor patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker. Tien patiënten werden gevaccineerd met p53-SLP in een fase I- en fase II-studie. Toxiciteit was aanvaardbaar en een p53-specifieke immuunrespons werd gedetecteerd bij 9 van de 10 patiënten. P53-specifieke T-celreactiviteit hield meer dan 6 maanden aan bij 6 van de 9 patiënten. Hoewel de studie fase I / II was, kan het klinische voordeel moeilijk te behalen zijn omdat de meeste patiënten T-helpercellen hadden die geen belangrijke cytokinen hadden. Preklinische fase I / II-studie van INGN-225 (Introgen), een door p53 gemodificeerd adenovirus-geïnduceerd dendritisch celvaccin voor patiënten met kleincellige longkanker (SCLC), is gerapporteerd. INGN-225 werd goed verdragen en induceerde een p53-specifieke immuunrespons bij 18/43 (41,8%) patiënten en maakte SCLC gevoelig voor daaropvolgende chemotherapie.
3. Conclusie
In dit artikel hebben we ons gericht op de functies van p53 en klinische toepassingen gericht op p53 voor kankertherapie. Ondanks recente vorderingen in het onderzoek naar de cytoplasmatische functie van p53, lijkt het erop dat er nog verschillende rollen moeten worden opgehelderd, behalve de functie als nucleaire factor. Van p53 is gerapporteerd dat het apoptose induceert, onafhankelijk van de transcriptie van genen, al in 1994. Verrassend genoeg kan geactiveerd p53 apoptose in het cytoplasma induceren door een bax-afhankelijk mechanisme.
Deze rapporten geven aan dat cytoplasmatisch p53 een transcriptie-onafhankelijk apoptotisch programma kan activeren. De volgende generatie van p53-gebaseerde kankertherapeutische benaderingen moet daarom worden ontwikkeld om te profiteren van deze cytosolische functie. Dit kan veiliger zijn dan het reguleren van de transcriptiemodulatie van wild-type p53, dat zowel prosurvival- als pro-apoptotische effecten in tumorcellen kan induceren, zoals hierboven besproken.
Recente rapporten hebben aangetoond dat p53 het proces van zelfredzaamheid reguleert. vernieuwing van neurale stamcellen en hematopoëtische stamcellen. Het kankerstammodel houdt vol dat tumoren in stand worden gehouden door een kleine populatie van kankerstamcellen die zowel symmetrisch als asymmetrisch kunnen delen. Verlies van p53 bevordert acute myeloïde leukemie door afwijkende zelfvernieuwing.
Van borststamcellen met de beoogde mutatie van p53 is gerapporteerd dat ze dezelfde eigenschappen vertonen als kankerstamcellen. De reactivering van p53 herstelde de asymmetrische celdeling van kankerstamcellen en veroorzaakte remming van de tumorgroei. Als gevolg hiervan kan verder onderzoek naar het verband tussen de p53-functie en kankerstamcellen daarom een van de belangrijkste onderzoeksgebieden zijn om nieuwe paradigma’s in kankertherapie te ontdekken.