Wprowadzenie

Horyzontalny transfer genów (HGT) między komórkami bakteryjnymi przyczynia się do adaptacji bakterii do różnych środowisk i, w dłuższej perspektywie, do ewolucji bakterii (Lorenz i Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas i Nielsen, 2005). Jednak w środowisku człowieka powoduje niepożądane rozprzestrzenianie się patogenności, oporności na antybiotyki lub sztucznie zmodyfikowanych genów (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly i in., 2009a, b). Ogólnie przyjmuje się trzy mechanizmy HGT u bakterii: koniugację, transdukcję i transformację (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Koniugacja i transdukcja obejmują określoną aparaturę do przenoszenia DNA z komórek dawcy do komórek biorców; są to odpowiednio koniugacyjne wiriony pilusów i fagów. Transformacja jest przede wszystkim funkcją komórek biorców, które wyrażają zdolność do przyjmowania zewnątrzkomórkowego nagiego DNA.

Kompetencja transformacyjna może być indukowana naturalnie lub sztucznie, ale nie wszystkie gatunki bakterii rozwijają naturalną zdolność (Lorenz i Wackernagel, 1994; Johnston i in., 2014). U naturalnie transformowalnych bakterii kompetencja jest zwykle przemijająca i jest indukowana zmianami w stanie wzrostu organizmu (Johnston i in., 2014). Zidentyfikowano grupę „genów kompetencji” i zaproponowano ogólne modele mechanistyczne (Chen i Dubnau, 2004), chociaż precyzyjne mechanizmy dotyczące poszczególnych gatunków bakterii nie zostały dostatecznie wyjaśnione (Cameron i Redfield, 2006, 2008; Sinha i in. ., 2009; Seitz i Blokesch, 2013; Johnston i in., 2014; Jaskólska i Gerdes, 2015) .Ponieważ transformacja wymaga zewnątrzkomórkowego nagiego DNA jako substratu, wrażliwość na DNazę, która degraduje nagie DNA, jest kluczem do odróżnienia transformacji od innych Mechanizmy HGT oporne na DNazę (Lorenz i Wackernagel, 1994; Giovanetti i in., 2005; Marshall i in., 2010; Rohrer i in., 2012; Blesa i Berenguer, 2015).

Ogólnie rzecz biorąc, Uważa się, że Escherichia coli nie ulega naturalnej transformacji; rozwija wysokie kompetencje genetyczne tylko w sztucznych warunkach, w tym w ekspozycji na wysokie stężenia Ca2 + i szok temperaturowy (Mandel i Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook i in., 1989), glikol polietylenowy leczyć ment (Chung i wsp., 1989; Sambrook i wsp., 1989) lub porażenie prądem (Sambrook i Russell, 2006). Jednak podobno E. coli może wykazywać umiarkowane kompetencje w pewnych warunkach, które są możliwe do wykonania w jej naturalnym środowisku (Baur i in., 1996, Bauer i in., 1999; Tsen i in., 2002; Woegerbauer i in., 2002) . Poniżej definiujemy transformację, w której plazmid został dodany zewnętrznie jako transformację plazmidową (PT) i transformację, w której plazmidowy DNA pochodzi z martwych komórek bakteryjnych (ze środowiska) jako poziomy transfer plazmidu przez transformację (HPTT).

Wydaje się, że Escherichia coli posiada wiele mechanizmów wychwytu DNA, w tym dwa popularne mechanizmy: jeden zależny od „genów kompetencji”, które powszechnie działają u wielu bakterii Gram-ujemnych i -dodatnich (Finkel i Kolter, 2001; Palchevskiy i Finkel, 2006; Sinha i in., 2009; Sinha and Redfield, 2012; Seitz i Blokesch, 2013; Johnston i in., 2014; Jaskólska i Gerdes, 2015). Mechanizm ten jest głównie kierowany przez specyficzny aparat molekularny utworzony wokół powierzchni komórki struktury, które przechodzą przez błony komórkowe tylko liniowy jednoniciowy DNA wytwarzany przy użyciu specyficznej nukleazy peryplazmatycznej. U E. coli geny te nie są uważane za przyczyniające się do PT, ponieważ PT wymaga pobrania nienaruszonych podwójnych rozdrobniony kolisty DNA (Sinha i Redfield, 2012; Johnston i in., 2014). Dlatego jest mało prawdopodobne, aby ten mechanizm przyczyniał się do PT w środowisku. Drugi mechanizm jest zależny od zewnętrznych czynników środowiskowych, takich jak dwuwartościowe jony metali, szok termiczny i naprężenia fizyczne (Mandel i Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán i in., 2013). Powszechnie uważa się, że te bodźce indukują tworzenie się struktur przypominających pory na powierzchni komórki w celu przejścia nienaruszonego dwuniciowego DNA, w tym kolistych plazmidów, chociaż szczegóły pozostają niejasne (Reusch i wsp., 1986; Reusch i Sadoff, 1988; Huang i Reusch, 1995; Sun i in., 2013; Asif i in., 2017). Jony Ca2 + i Mg2 + to najbardziej typowe czynniki wywołujące kompetencje. Siedliska środowiskowe często zawierają kilka milimoli tych jonów, których stężenia są wystarczające do wywołania słabej, ale wykrywalnej kompetencji u E. coli (Baur i in., 1996, Bauer i in., 1999; Maeda i in., 2003). Dlatego ten mechanizm jest możliwy w środowisku poza laboratoriami. Oprócz powyższych dwóch mechanizmów Sun i in. Zaproponowali inny mechanizm. (2006, 2009), Zhang i in. (2012), Guo i in.(2015) i Sun (2016), w których zaangażowany jest transporter ABC oraz specyficzne białka peryplazmatyczne i błony wewnętrznej. Mechanizm ten jest regulowany przez wewnętrzne regulatory transkrypcji, RpoS i CRP, dlatego zasugerowano, że ten mechanizm jest również genetycznie kontrolowanym procesem naturalnym.

W tym mini przeglądzie podsumowujemy nasze badania nad HGT przy użyciu E. coli eksperymentalnych i omówienie możliwego wystąpienia transformacji przez wiele mechanizmów w środowisku naturalnym i jej możliwego wpływu na rozprzestrzenianie się genów oporności na antybiotyki.

Transformacja plazmidowa E. coli w warunkach naśladujących naturalne środowisko

PT w ekstraktach z żywności

Żywność ludzka jest doskonałą pożywką dla wielu bakterii. Jednak niewiele uwagi poświęcono wpływowi żywności na fizjologię bakterii poza wzrostem i przetrwaniem. Zbadaliśmy możliwość, że żywność działa jako pożywka do transformacji bakterii. Żywność często zawiera milimolowe stężenia dwuwartościowych jonów metali (Ca2 + i Mg2 +) i często jest przechowywana w lodówce lub zamrażarce, po czym następuje szybkie ogrzewanie (tj. Szok termiczny). Warunki te sprzyjają rozwojowi kompetencji u E. coli (Mandel i Higa, 1970; Huang i Reusch, 1995; Baur i in., 1996); ponieważ E. coli jest powszechnym zanieczyszczeniem żywności, interesujące jest ustalenie, czy można je przekształcić w żywności. Niektóre pokarmy mogą rzeczywiście działać jako media, które wywołują kompetencje w E. coli (Maeda i in., 2003). Spośród 42 przebadanych próbek żywności > 10 wykazywało zdolność wywoływania kompetencji przy częstotliwości 10−7−10−9. Spośród nich supernatant z tofu (podobny do sera pokarm z zsiadłego mleka sojowego) wykazywał najwyższą aktywność (jedna na 10−7−10−8 komórek biorców), odpowiadającą około połowie wydajności uzyskanej przy 100 mM CaCl2. Nie było jednak wyraźnych korelacji między częstotliwością przemian a właściwościami chemicznymi żywności (stężenie Ca2 + lub Mg2 + i pH), co sugeruje, że złożone czynniki w żywności wpływają na rozwój kompetencji. Podobny wpływ pokarmów na indukowanie transformacji opisano u E. coli (Bauer i wsp., 1999) i Bacillus subtilis (Brautigam i wsp., 1997; Zenz i wsp., 1998).

PT w Biofilm Solid-Air

Wiele bakterii występuje w postaci biofilmów w środowisku naturalnym i sztucznym (Davey i O’Toole, 2000). Biofilmy to skupiska drobnoustrojów, które tworzą się na granicy faz ciało stałe-ciecz lub ciało stałe-powietrze (SA) (Anderl i in., 2000; Carmen i in., 2004). Komórki w tych kulturach o dużej gęstości oddziałują ze sobą i wykazują charakterystyczne funkcje fizjologiczne w porównaniu z ich wolnymi formami planktonu. Wcześniejsze badania nad transformacją E. coli koncentrowały się wyłącznie na komórkach planktonowych (Mandel i Higa, 1970; Hanahan, 1983), ale wykazaliśmy, że komórki E. coli w biofilmach SA rozwijają kompetencje z częstotliwością 10−6−10−8 na różne podłoża stałe, w tym agar LB i H2O oraz różne wilgotne pokarmy (Maeda et al., 2004). Żywe komórki na ogół współistnieją z martwymi komórkami w biofilmach, a te ostatnie mogą uwalniać swoje DNA i pewne dwuwartościowe jony metali, w tym Ca2 + i Mn2 +, do lokalnego mikrośrodowiska biofilmu (Davey i O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Warunki te mogą sprzyjać rozwojowi transformacji i mogą nie występować wyłącznie w biofilmach SA, ponieważ odnotowano również podobne wzmocnienie biofilmów E. coli powietrze-ciecz (Król i in., 2011).

PT dzikich szczepów E. coli w wodzie

Nasze i innych wyniki sugerują, że środowiskowe E. coli mogą potencjalnie nabywać obce DNA poprzez transformację. Istnieje jednak kilka wcześniejszych doniesień z badań nad transformowalnością naturalnych szczepów E. coli (Woegerbauer i wsp., 2002; Sinha i Redfield, 2012). Dlatego zbadaliśmy potencjał naturalnych szczepów E. coli w rozwijaniu kompetencji w warunkach środowiskowych. Użyliśmy standardowego zbioru referencyjnych szczepów E. coli (ECOR) jako naszego modelu naturalnych E. coli (Ochman i Selander, 1984), ponieważ te szczepy ECOR były szeroko stosowane w różnych badaniach nad fizjologią, zachowaniem i zmiennością genotypową naturalne E. coli (Tenaillon i wsp., 2010). Odkryliśmy, że niektóre szczepy ECOR wykazywały wykrywalną transformowalność (10-10-10-11) w wodzie naturalnej (dostępna w handlu naturalna czysta woda butelkowana) w stałych i zmiennych temperaturach od 5 do 35 ° C oraz w temperaturach zimowych w eksperymencie polowym, sugerując że naturalna E. coli może potencjalnie rozwinąć kompetencje w pewnych warunkach, które mogłyby wystąpić w środowisku (Matsumoto i in., 2016b).

Horyzontalny transfer plazmidu przez transformację w E. coli

HPTT wywołane zamrażaniem i rozmrażaniem w wodach naturalnych i ekstraktach żywności

W środowisku nagie DNA może być naturalnie dostarczane z martwych komórek do sąsiednich komórek w tym samym środowisku lub mikrośrodowisku.Dlatego warto zbadać możliwość HPTT w systemie zamkniętym w pewnych wykonalnych warunkach. Zamrażanie-rozmrażanie jest powszechnym procesem w obchodzeniu się ze środkami spożywczymi i występuje również w przyrodzie. Traktowanie komórek E. coli przez zamrażanie i rozmrażanie może sprzyjać wyciekaniu DNA z martwych komórek i późniejszemu wychwytowi przez komórki, które przeżyły, ponieważ reagują one na szok cieplny, powodując transformację in situ (Li i wsp., 1992; Takahashi i wsp., 1992). Taka obróbka skondensowanych zawiesin mieszanych szczepów E. coli w wodach naturalnych i ekstraktach spożywczych spowodowała boczny transfer niekoniugatywnych plazmidów in situ z częstotliwością 10−8−10−10 (Ishimoto i in., 2008). Zjawisko to występowało również po 1-2 miesiącach przechowywania w temperaturze -20 ° C, a jego wrażliwość na DNazę wykazała, że zachodzi za pośrednictwem mechanizmu transformacji.

Niska częstotliwość HPTT w biofilmach SA

Uważa się, że biofilmy są odpowiednim środowiskiem do transformacji in situ, ponieważ żywe i martwe komórki współistnieją blisko siebie, a DNA uwolnione z martwych komórek często gromadzi się wokół żywych komórek. Ponadto, jak opisano powyżej, ponieważ komórki E. coli mogą rozwinąć niewielkie kompetencje w biofilmach SA (Maeda i in., 2004), oba te czynniki przyczyniają się do HPTT w biofilmach. Po prostu przez wspólną hodowlę szczepu wolnego od plazmidu z jednym zawierającym niekoniugacyjny plazmid w biofilmie SA na podłożu agarowym wolnym od antybiotyków, transformowane komórki wytwarzano z niską częstotliwością (10–9–10–10) w ciągu 24–48 godzin (Maeda i in., 2006). Płynne hodowle tych samych szczepów w bulionie LB nie wytwarzały żadnych transformantów lub ich niewiele, co sugeruje znaczenie tworzenia biofilmu SA dla transferu plazmidu. Zasadniczo to samo zjawisko wystąpiło w biofilmach SA na podłożach spożywczych (Ando i in., 2009). Zjawisko to wystąpiło również między popularnymi szczepami laboratoryjnymi, takimi jak DH5, HB101 i MG1655 (Etchuuya et al., 2011), które są wolne od lizogennych fagów i aparatury koniugacyjnej, co sugeruje, że niska częstotliwość poziomego transferu plazmidów w biofilmach SA może zachodzą bez pomocy faga lub maszynerii koniugacyjnej, a zatem transfer DNA jest wynikiem pewnego rodzaju transformacji. Jednakże, ponieważ mutacja rpoS− nie wpłynęła na HPTT (Maeda i in., 2006), jest mało prawdopodobne, aby zaangażowany był mechanizm zależny od RpoS (Zhang i in., 2012).

Wysoka częstotliwość HPTT Indukowany przez faga P1

Oceniając kombinacje kilku szczepów i plazmidów do poziomego transferu plazmidu, stwierdzono, że szczep E. coli CAG18439 działa zarówno jako dawca plazmidu, jak i biorca plazmidu w połączeniu z plazmidem pHSG299 i może często przenosić plazmid w mieszanej hodowli komórkowej, nawet w płynnej pożywce (Etchuuya et al., 2011). Ten HGT okazał się być rodzajem transformacji, ponieważ transfer plazmidów o wysokiej częstotliwości (10-5-10-8) był wrażliwy na DNazę. Dalsze badania ujawniły, że zjawisko to wykazuje pewne specyficzne cechy: (1) promocja przez czynnik białkowy uwalniany z CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) promocja przez sekwencję 88 pz na pHSG299 (Sobue i wsp., 2011); (3) wysoka częstotliwość transferu (Etchuuya i in., 2011; Sobue i in., 2011); oraz (4) zależność od określonych genów (Kurono i in., 2012; Matsuda i in., 2012). W odniesieniu do (1), późniejsze badanie ujawniło, że te czynniki białkowe obejmują cząstkę faga P1vir (lub jego pochodną) i że zewnętrznie dodany fag P1vir może odtwarzać poziomy transfer plazmidu między komórkami E. coli i trzema innymi głównymi cechami CAG18439 -zależny HPTT (Sugiura i in., 2017). Zjawisko to było również w dużej mierze wrażliwe na DNazę, co sugeruje, że duża część tego transferu plazmidu wynika z transformacji pomimo udziału faga P1. Mechanizm transformacji indukowanego przez faga P1vir transferu plazmidu może wynikać z infekcji fagowej lub spontanicznego przebudzenia zlizogenizowanego faga w komórkach niosących plazmid, co prowadzi do lizy komórek, a następnie do uwolnienia wewnątrzkomórkowego plazmidowego DNA w postaci nadającej się do transformacji. Chociaż taki mechanizm jest ogólnie możliwy do zrealizowania, było kilka wyraźnych dowodów na to u E. coli. Niedawne badanie Keen i wsp. (2017) przy użyciu innego systemu fagowego również wykazali podobny mechanizm transformacji indukowanej przez fagi u E. coli. Jednak HPTT przez P1vir lub CAG18439 nie może być odpowiednio wyjaśniony jedynie przez zwiększoną podaż DNA z lizy komórek indukowanej przez fagi i różni się ona od prostej transformacji E. coli (Hanahan, 1983) swoimi charakterystycznymi cechami (2–4). W odniesieniu do (2), sekwencja 88 pz na pHSG299 nie jest homologiczna z częścią sekwencji genomu faga P1. Sekwencja ta jest często spotykana w bazach danych wśród ogólnych sekwencji wektorów do klonowania, ale nie w żadnym naturalnym źródle. Śledząc proces konstruowania pHSG299 (Hashimoto-Gotoh i wsp., 1981; Brady i wsp., 1984; Takeshita i wsp., 1987) podejrzewamy jednak, że sekwencja 88 pz pochodzi z R6-5, a koniugacyjny plazmid R.Ta sekwencja i podobne elementy DNA mogą przyczyniać się do HPTT R i innych plazmidów w środowisku. W odniesieniu do (3) tego transferu wysokiej częstotliwości nie można wyjaśnić prostą zdolnością do PT CAG18439 i innych użytych szczepów, ponieważ prosta PT w tych szczepach w równoważnych warunkach hodowli była 105–102 razy rzadsza (Etchuuya et al., 2011). Dlatego zasugerowano, że czynnik białkowy pochodzący z CAG18439, o wielkości szacowanej na 9 do 30 kDa (Etchuuya i wsp., 2011) może również być zaangażowany w promowanie HPTT. Ten czynnik przypuszczalnie pomaga w pobieraniu DNA przez komórki biorcy, prawdopodobnie w połączeniu z sekwencją 88 pz transformującego DNA. Wreszcie, w odniesieniu do (4), późniejsze badania przesiewowe całego genomu pod kątem genów biorców zaangażowanych w HPTT sugerują, że w mechanizmie uczestniczy wiele genów (Kurono i in., 2012; Matsuda i in., 2012; Shibata i in., 2014a ). Należą do nich te, które nie były zaangażowane w naturalną lub sztuczną transformację E. coli (takie jak rodZ) oraz kilka znanych homologów genów kompetencyjnych, takich jak ybaV i yhiR (Finkel i Kolter, 2001; Palchevskiy i Finkel, 2006 ), ale nie obejmują rpoS i innych genów związanych z mechanizmem zależnym od RpoS (Zhang et al., 2012). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują na nieznany, złożony mechanizm indukowanego przez fagi HPTT o wysokiej częstotliwości, który może częściowo dzielić szlak naturalnej transformacji.

HPTT pomiędzy naturalnymi szczepami E. coli

Aby dokładniej ocenić ogólność i różnorodność HPTT w szczepach E. coli, w badaniu HPTT wykorzystano naturalne szczepy (wspomniane powyżej szczepy ECOR). Kilka kombinacji szczepów ECOR hodowano wspólnie w płynnych pożywkach, uzyskując wrażliwy na DNazę poziomy transfer naturalnych genów oporności na antybiotyki (Matsumoto i wsp., 2016a, b). Izolacja plazmidu z tych nowych transformantów wykazała poziomy transfer plazmidu między szczepami ECOR (Matsumoto i wsp., 2016a, b). Proste eksperymenty PT z użyciem tych samych szczepów ECOR ujawniły, że HPTT występuje znacznie częściej (10−6−10−8) niż prosta PT (poniżej 10−10) w tych samych warunkach hodowli, co sugeruje, że HPTT jest wyjątkowa i skuteczna. Co więcej, odkryliśmy, że 6 z 12 kombinacji szczepów ECOR, z których niektóre nie wytwarzają fagów tworzących blaszki (Shibata i wsp., 2014b), wykazywało wrażliwy na DNazę transfer genów, co prowadzi nas do podejrzenia, że HPTT jest raczej powszechne w naturalnym Szczepy E. coli. Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że pewne mechanizmy transformacji wolne od fagów i koniugatów również naturalnie istnieją w niektórych szczepach E. coli i że HPTT opornych na antybiotyki naturalnych plazmidów (takich jak plazmidy szczepu ECOR24: numery dostępu AB905284 i AB905285) może być ścieżką do wytwarzania opornych na wiele leków naturalnych komórek E. coli.

Możliwe mechanizmy i wykonalność PT i HPTT u E. coli w środowisku

Przykłady PT i HPTT o niskiej częstotliwości wywołane zamrażaniem i rozmrażaniem, przedstawione w tym mini przeglądzie, są prawdopodobnie bardziej związane z mechanizmem tworzenia porów niż z mechanizmem zależnym od genów kompetencji, ponieważ żywność i wody naturalne często zawierają mM jonów Ca2 + i Mg2 + (Baur et al., 1996, Bauer i in., 1999; Maeda i in., 2003), a środowisko biofilmu dostarcza żywym komórkom zawartość martwych komórek, w tym dwuwartościowych jonów metali i transformowalnego plazmidowego DNA. Jak opisaliśmy wcześniej (Maeda i wsp., 2006), biofilm SA (średnica 10–12 mm; grubość 0,5–0,8 mm) zawiera około 2–5 x 109 komórek. Ponadto liczba bakterii jelitowych u ssaków wynosi na ogół około 1011 komórek / g (Zoetendal i in., 2004; Sekirov i in., 2010). Biorąc pod uwagę ogromną skalę środowiska, nie można lekceważyć nawet częstotliwości transformacji 10−9−10−10, ponieważ będą one miały wpływ na populacje bakterii.

Wysokoczęstotliwościowe HPTT opisane w tym artykule mogą obejmować nie tylko mechanizm tworzenia porów, ale także część funkcji genów kompetencyjnych i być może inny nieznany mechanizm, jak wspomniano powyżej. Ponieważ bakteriofagi są jednymi z najliczniej występujących organizmów w biosferze i wszechobecnych w środowisku (Clokie i wsp., 2011), uważa się, że indukowana przez fagi HPTT jest również możliwa do wykonania w środowisku, podobnie jak zwykła transdukcja i inne pochodzące z fagów sposoby HGT, np. środki przenoszące gen (Lang i in., 2012).

Wnioski i perspektywa

Ogólnie nasze wyniki i powiązane wcześniejsze dane wskazują, że wiele mechanizmów indukuje transformację typ HGT u E. coli w oparciu o różne warunki środowiskowe i komórkowe, takie jak rodzaj pożywki (np. woda i żywność), zmienna temperatura od poniżej zera do ∼40 ° C, wysoka gęstość komórek w biofilmach i zróżnicowane podłoże genetyczne zaangażowanych szczepów. Udział HGT typu transformacyjnego w dynamice genetycznej środowiska może być niedoceniany (Bushman, 2002; Thomas i Nielsen, 2005), a nasze badania wskazują, że HPTT u E.coli występuje przy znacznych częstotliwościach przenoszenia (10–5–10–10) w warunkach, które można praktycznie spotkać w środowisku. Dlatego HGT typu transformacyjnego może przyczyniać się do rozprzestrzeniania genów oporności na antybiotyki i pojawienia się bakterii wielolekoopornych w rzeczywistym środowisku poza laboratoriami. Konieczne są dalsze badania, aby zrozumieć dokładną rolę i wkład HGT typu transformacyjnego w szerzeniu oporności na antybiotyki.

Wkład autorów

HH, ES i SM napisali artykuł.

Finansowanie

Praca została wsparta przez JSPS KAKENHI (grant nr 25292051).

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy deklarują, że badanie przeprowadzone w przypadku braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby zostać zinterpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni firmie Enago (www.enago.jp) za język angielski usługi redagowania i korekty.