Metoda eksperymentalna

Podobnie jak wzór użyty do obliczenia stosunku sygnału do szumu może mieć dramatyczny wpływ na widoczna czułość dowolnego konkretnego zestawu danych spektralnych, konfiguracja sprzętowa instrumentu i parametry eksperymentalne akwizycji danych również mają ogromny wpływ na jakość uzyskanego widma.

Istnieje wiele parametrów sprzętowych, ustawienia i opcje, które wszystkie mają wpływ na mierzoną czułość spektrofluorometru. Może to bardzo utrudnić bezwzględne porównanie względnej czułości dwóch różnych instrumentów, jeśli nie są one używane w praktycznie identyczny sposób. Poniżej omawiamy każdy z tych czynników i wpływ, jaki mają na otrzymane dane.

Dotyczy wszystkich fluorometrów skanujących

Długość fali wzbudzenia: Długość fali wzbudzenia powinna być identyczna dla wszystkich porównywanych systemów. Metoda HORIBA wykorzystuje wzbudzenie 350 nm dla pasma Ramana wody, podobnie jak większość innych producentów. Podczas wzbudzania przy 350 nm, pasmo emisji Ramana dla wody ma pik przy 397 nm.

Na szczęście większość producentów ustandaryzowała tę długość fali wzbudzenia, ponieważ pozwala to na lepsze porównanie. Jednak w pełni uzasadnione jest przesunięcie długości fali wzbudzenia na dowolną inną wartość, aby przetestować czułość w innym zakresie długości fal (np. NIR).

Zakres skanowania emisji: Metoda HORIBA skanuje monochromator emisji od 365 do 450 nm, z przyrostem 0,5 nm, tak aby zebrać cały pik Ramana przy 397 nm, a także tło przy 450 nm.

Szerokość pasma (rozmiar szczeliny): Metoda HORIBA wykorzystuje pasmo 5 nm szczeliny zarówno w spektrometrze wzbudzenia, jak i emisyjnym. Niektórzy producenci określają szczeliny 10 nm, co ma wpływ na zwiększenie czułości w porównaniu do 5 nm. Donoszono, że podwojenie fizycznego rozmiaru szczeliny na wejściu i wyjściu z monochromatora może czterokrotnie zwiększyć intensywność wzbudzenia i wydajność wykrywania emisji, ponieważ przepustowość idzie w miarę wzrostu kwadratu rozmiaru, ale jest to uproszczone oszacowanie, które należy zmierzyć empirycznie. HORIBA zmierzyła różnicę współczynników z HORIBA Fluoromax i zaobserwowała, że w przypadku Fluoromax podwojenie rozmiaru szczelin z 5 do 10 nm zwiększa całkowity stosunek sygnału do szumu dla pasma Ramana wody ponad trzykrotnie. Jednak będzie to inne dla wszystkich fluorometrów, więc upewnij się, że nie porównujesz z identycznymi pasmami pasm.

Czas integracji (lub czas odpowiedzi): odnosi się do tego, jak długo detektor może zbierać sygnał przy danym pozycja kroku długości fali. Odgrywa również znaczącą rolę w ogólnej czułości mierzonej dla fluorometru. Metoda HORIBA wykorzystuje 1-sekundowy czas całkowania w każdym punkcie długości fali, podobnie jak w przypadku innych producentów. Jednak niektórzy producenci określają 2-sekundowy czas odpowiedzi, który zwiększa ogólny stosunek sygnału do szumu prawie dwukrotnie. Upewnij się, że używasz tego samego czasu integracji (odpowiedzi) podczas porównywania.

Typ PMT: Większość spektrofluorometrów używa lampy fotopowielacza (PMT) jako jedynego detektora emisji fluorescencji, bez możliwości zmiany obudowy detektora. Dotyczy to większości laboratoryjnych fluorometrów analitycznych. Niektóre z tych stacjonarnych systemów pozwalają na wybór różnych indywidualnych PMT o różnych zakresach długości fal i specyfikacjach. PMT, które nie wykrywają tak głęboko w NIR, jak inne PMT, będą miały mniejszą liczbę ciemnych, dzięki czemu będą zapewniać lepszy stosunek sygnału do szumu w zakresie 350 do 400 nm, jednak mogą nie nadawać się do użytku na całej długości fali emisji zakres pożądany dla konkretnego laboratorium. Standardowym PMT firmy HORIBA, stosowanym w fluorometrach z serii FluoroMax Plus, Fluorolog3 i QuantaMaster 8000, jest Hamamatsu R928P PMT, który jest uważany za branżowy standard fluorometrii. W takich przypadkach upewnij się, że każdy fluorometr używa tego samego PMT, jeśli to możliwe.

Filtry optyczne: Filtr optyczny można dodać do ścieżki optycznej fluorometru, po stronie wzbudzenia lub po stronie emisji próbki. Można je ręcznie umieścić w uchwycie filtra wewnątrz komory na próbki lub mogą być częścią koła filtrów, które może automatycznie umieszczać różne filtry na ścieżce optycznej, gdy wybrane są różne protokoły eksperymentalne. Filtry optyczne poprawiają odrzucanie światła rozproszonego przy danych długościach fal i mogą znacznie poprawić stosunek sygnału do szumu we fluorometrze. Firma HORIBA nie używa żadnych filtrów optycznych, innych niż same spektrometry skaningowe, przy określaniu SNR dla wody Ramana zgodnie ze specyfikacjami serii Fluoromax, Fluorolog3 lub QuantaMaster 8000.Porównując fluorometr HORIBA z fluorometrem wykorzystującym filtry automatyczne, nie używaj filtra, a jeśli jest automatyczny, potwierdź, jaka marka i typ filtrów są używane i gdzie są one używane, aby powtórzyć podobną metodę eksperymentalną z a fluorometr HORIBA.

Dotyczy modułowych fluorometrów badawczych

Typ detektora: Modułowe fluorometry badawcze zwykle zawierają standardowo obudowę PMT, ale pozwalają na wiele różnych typów detektorów jednokanałowych w celu przedłużenia długości fali zakres, czyli zakres czasu życia fluorescencji instrumentu. Alternatywne detektory obejmują chłodzone obudowy PMT, różne detektory półprzewodnikowe, takie jak InGaA, MCP PMT i tak dalej. Te różne typy detektorów będą miały dramatyczny wpływ na stosunek sygnału do szumu w każdym konkretnym pomiarze próbki, więc tutaj ponownie, próbując porównać czułość jednego fluorometru z innym, upewnij się, że ten sam typ detektora jest używany do zbierania danych oba systemy.

Temperatura detektora: Większość komercyjnych spektrofluorometrów używa obudów PMT, które nie są chłodzone, aw rzeczywistości wiele przyrządów nie oferuje nawet opcji chłodzonego detektora. Chłodzona obudowa PMT może poprawić czułość instrumentu poprzez zmniejszenie liczby ciemnych (tła) w porównaniu z tym samym dokładnym PMT w obudowie otoczenia. Standardowe obudowy PMT firmy HORIBA w modelach FluoroMaxPlus, Fluorolog3 i QuantaMaster 8000 to obudowy PMT do otoczenia, jednak seria Fluorolog3 i QuantaMaster 8000 oferuje opcjonalne chłodzone obudowy PMT w celu poprawy czułości i wykrywania NIR. Porównując modułowe fluorometry badawcze, pamiętaj, aby porównać dane zebrane dla tego samego typu obudowy PMT (otoczenia lub chłodzonej), a jeśli są chłodzone, to także schładzane do tej samej temperatury.

Pojedynczy i podwójny monochromator: modułowy Badania fluorometrów pozwalają badaczowi wybrać pojedynczy lub podwójny monochromator na wzbudzającej lub emisyjnej ścieżce optycznej. Tutaj termin podwójny monochromator odnosi się do dwóch stopni siatki dyspersyjnej, jeden po drugim, ze szczeliną wejściową, szczeliną pośrednią i szczeliną wyjściową. Podwójny monochromator można skonfigurować w trybie addytywnym lub dyspersyjnym, ale w każdym przypadku przepustowość i charakterystyka światła rozproszonego pojedynczego i podwójnego monochromatora są bardzo różne i będą miały duży wpływ na SNR skanu Ramana wody, nawet jeśli szerokości pasma, czasy całkowania i długości fal są utrzymywane na stałym poziomie.

Gęstość rowków siatki: Gęstość rowków siatki również wpływa na przepustowość, a tym samym czułość spektrofluorometru. W przypadku większości spektrofluorometrów nie stanowi to zbyt dużego problemu, ponieważ systemy są produkowane tylko z jedną konkretną siatką. W tym przypadku najważniejsze jest upewnienie się, że pasma są dobrane tak, aby były takie same. Jednak w przypadku fluorometrów modułowych można skonfigurować monochromatory z różnymi siatkami lub wieloma siatkami. W przypadku tych systemów należy bardzo uważać, aby rzeczy były jak najbardziej podobne. Na przykład, gdy masz dwa instrumenty, które mają podobne spektrometry ogniskowej, zmiana gęstości rowków siatki zwiększy lub zmniejszy czułość dla tego samego ustawienia pasma 5 nm. W metodzie HORIBA wykorzystuje się siatki o gęstości rowków 1200 rowków na milimetr.

Blaze Angle of Grating: Kraty wybrane do wzbudzania lub emisji monochromatora zapewniają optymalną przepustowość w określonym paśmie długości fali, zwanym płomieniem kąt, ponieważ jest to określone przez kąt wytrawiania kratowego wywieranego na powierzchnię siatki. Jako taki monochromator wzbudzający z monochromatorem wzbudzającym z płomieniem 350 nm i monochromatorem emisyjnym 400 nm byłby optymalnym wyborem dla osiągnięcia najlepszej czułości Ramana na wodę przy wzbudzaniu przy 350 nm. Ponieważ większość fluorometrów nie pozwala na regulację siatki, ta zmienna nie jest czynnikiem, ale dla tych, które pozwalają na wybór kratek, upewnij się, że wybierasz kratki z tym samym lub bardzo podobnym kątem świecenia, aby dokonać prawidłowego porównania .