Ostatnie postępy w badaniach nad p53 i leczeniu raka
Streszczenie
TP53, kodujący p53, jest jednym z najbardziej znanych genów supresorowych nowotworów. Większość ludzkich raków wykazuje inaktywację szlaku p53. Zmutowany p53 nie tylko nie działa już jako supresor guza, ale może również wywierać działanie promujące nowotwór. Podstawową funkcją p53 jest reagowanie na stres komórkowy. W niniejszym artykule dokonujemy przeglądu ostatnich postępów w badaniach nad p53 i skupiamy się na apoptozie, zatrzymaniu cyklu komórkowego i starzeniu się w odpowiedzi na stres. Dokonujemy również przeglądu zastosowań klinicznych terapii raka u ludzi opartej na p53.
1. Wprowadzenie
Gen TP53, który koduje p53, jest jednym z najczęściej mutowanych genów w ludzkich nowotworach. Poinformowano, że około połowa wszystkich nowotworów ma inaktywowany p53. Białko p53 ma szeroki zakres funkcji biologicznych, w tym regulację cyklu komórkowego, apoptozę, starzenie się, metabolizm DNA, angiogenezę, różnicowanie komórkowe i odpowiedź immunologiczną. W wielu publikacjach opisano różne funkcje p53, w tym role transkrypcyjne, posttranskrypcyjne i posttranslacyjne.
W tym artykule skupimy się na kwestiach dotyczących p53 i zastosowania terapii przeciwnowotworowych opartych na p53. Jak przejrzeli Vousden i Prives, główne funkcje p53 to regulacja zahamowania wzrostu i apoptozy.
2. Normalne funkcje p53
Liczne badania wykazały, że p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który celuje w wiele genów i mikroRNA w odpowiedzi na stres w piwnicy. Kluczową rolą p53 jako supresora nowotworów jest blokowanie progresji cyklu komórkowego i / lub indukowanie apoptozy w odpowiedzi na stres komórkowy, taki jak uszkodzenie DNA. Upośledzona aktywność p53 sprzyja akumulacji uszkodzeń DNA w komórkach, co prowadzi do fenotypu raka. Jako czynnik transkrypcyjny p53 tworzy zróżnicowaną i złożoną sieć regulatorową genów. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania, aby wyjaśnić sekwencje docelowe, które rozpoznaje p53, element odpowiedzi p53 (RE), jak ostatnio omówili Riley i in. p53 ma bardzo szeroki zakres aktywności biologicznych, więc niniejszy przegląd skupi się na roli p53 jako supresora guza i jego konsekwencjach w leczeniu raka.
2.1. Raki ludzkie i mutacje p53
Częstość mutacji TP53 waha się od ~ 10% (nowotwory układu krwiotwórczego) do 50-70% (nowotwory jajników, jelita grubego i głowy i szyi). Mutacja linii germinalnej TP53 powoduje zespół Li-Fraumeni, który jest rodzinnym zespołem nowotworowym obejmującym raka piersi, mięsaka tkanek miękkich i różne inne rodzaje raka. Większość mutacji TP53 w ludzkich rakach powoduje mutacje w obrębie domeny wiążącej DNA, uniemożliwiając w ten sposób transkrypcję genów docelowych p53. Jednak zmutowany p53 nie tylko doprowadził do utraty normalnej funkcji białka typu dzikiego, ale także doprowadził do nowych zdolności do promowania raka. Pierwszym doniesieniem o tym uzyskaniu funkcji przez zmutowany p53 była obserwacja, że transfekcja zmutowanego p53 do komórek zerowych p53 nasila tworzenie się guza u myszy. Liczne późniejsze badania potwierdziły to odkrycie.
2.2. p53 jako Tumor Suppressor
2.2.1. p53 jako czujnik uszkodzeń DNA
Niestabilność genetyczna jest jedną z najważniejszych cech nowotworów złośliwych. Istnieją bardzo wyrafinowane systemy wykrywania uszkodzeń DNA i naprawy genomu. p53 odgrywa ważną rolę w takich systemach „opiekuńczych”. Kiedy p53 reaguje na uszkodzenie DNA, wywołuje zatrzymanie cyklu komórkowego lub apoptozę.
W 1991 roku wykazano, że indukcja p53 typu dzikiego może indukować apoptozę w komórkach białaczki. Myszy, które mają specyficznego mutanta p53, nie mają zdolności do wywoływania zatrzymania cyklu komórkowego, ale zachowują zdolność do indukowania apoptozy, co pozwala im skutecznie hamować nowotwory wywołane onkogenem, co sugeruje, że proapoptotyczna funkcja p53 może odgrywać bardziej istotna rola w jego działaniu przeciwnowotworowym niż w indukowaniu zatrzymania cyklu komórkowego.
2.2.2. p53 i apoptoza
W licznych doniesieniach opisano mechanizm, za pomocą którego p53 indukuje apoptozę. Jako p53 działa głównie jako czynnik transkrypcyjny, ważne jest zbadanie genów regulowanych przez p53, które przyczyniają się do regulacji apoptozy. Wczesne badania wykazały, że p53 typu dzikiego może wiązać region promotora genu bax i regulować transkrypcję genu bax. bax jest członkiem Bc rodzina l-2, która tworzy heterodimery z Bcl-2, hamując jego aktywność. Rodzina białek Bcl-2 odgrywa ważną rolę w apoptozie i raku. Na przykład Bcl-2 kontroluje uwalnianie cytochromu c z mitochondriów, który aktywuje ścieżkę apoptozy poprzez aktywację kaspazy 9. Kaspaza 9 aktywuje następnie kaspazę wykonawczą 3. Obie kaspazy odgrywają kluczową rolę w szlaku apoptozy.
Kilka ludzkich nowotworów, w tym raka okrężnicy i żołądka, ma zmienioną ekspresję Bcl-2. Jednak znaczenie poziomu ekspresji Bcl-2 w rokowaniu pacjentów z rakiem jest nadal badane.Wkład ekspresji bax w rokowanie chorych na raka i odpowiedź na terapię również jest niejasny. W przypadku raka piersi badanie wykazało, że niski poziom ekspresji bax wiąże się ze złym rokowaniem, podczas gdy inne doniesienia nie wykazały korelacji między poziomem ekspresji bax a rokowaniem. Konieczne będą zatem dalsze badania.
CD95 (zwany także Fas i Apo-1) jest „receptorem śmierci” wskazującym na jego główną rolę w apoptozie. Pierwsze doniesienie z CD95 wykazało, że przeciwciało anty-CD95 zmniejszyło wzrost ludzkich ksenoprzeszczepów guzów komórek B. Od tego czasu opublikowano liczne doniesienia na temat indukowanej przez CD95 szlaku sygnałowego w apoptozie. Środki cytotoksyczne, takie jak leki chemioterapeutyczne, mogą wywoływać apoptozę w komórkach wrażliwych na leki. Dlatego ważne jest, aby wyjaśnić, który szlak (y) sygnałowy (e) najbardziej przyczynia się do apoptozy. Wyjaśnienie tych informacji byłoby pomocne w odkrywaniu leków.
W kilku raportach wskazano, że szlak CD95 odgrywa ważną rolę w apoptozie indukowanej przez środki cytotoksyczne, i że system ten obejmuje aktywację p53 typu dzikiego. Dlatego status p53 może wpływać na wrażliwość chemiczną poprzez sygnalizację CD95. Jednak niedawny raport wskazał, że CD95 może sprzyjać wzrostowi guza. Zaprogramowana śmierć komórki jest bardzo skomplikowana di zależy od wielu czynników.
Istnieje podrodzina Bcl-2, która zawiera tylko domenę BH3. Zidentyfikowano kilka białek tylko BH3, a p53 działa jako czynnik transkrypcyjny dla PUMA i NOXA, które należą do tej klasy. PUMA jest również kluczowym mediatorem szlaku apoptozy indukowanego przez p53.
Kiedy PUMA zostaje przerwana w komórkach raka okrężnicy, zapobiega się apoptozie indukowanej przez p53. PUMA może odgrywać kluczową rolę w określaniu losu komórki (programowana śmierć komórki w porównaniu z zatrzymaniem cyklu komórkowego) w odpowiedzi na aktywację p53. Raport o myszach z nokautem PUMA wykazał, że nokaut PUMA przywraca apoptotyczny niedobór obserwowany u myszy z nokautem p53. PUMA jest podstawowym mediatorem zależnej i niezależnej od p53 apoptozy in vivo. Ponieważ unikanie apoptozy jest jedną z cech charakterystycznych raka, PUMA może również odgrywać ważną rolę podczas kancerogenezy.
Ostatnie doniesienia wykazały jednak, że w pewnych sytuacjach apoptoza może sprzyjać karcynogenezie. Michalak i in. i Labi i in. wykazali, że utrata limfomagenezy grasicy wywołanej promieniowaniem gamma spowodowanej ablacją PUMA. Hmatopoetyczne komórki macierzyste z niedoborem PUMA są chronione przed śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem gamma, co zmniejsza kompensacyjną proliferację i replikację. Z drugiej strony myszy typu dzikiego doświadczają masywnej śmierci komórek, gdy otrzymały napromienianie promieniami gamma, co następnie doprowadziło do ponownego zasiedlenia regionu przez komórki macierzyste / progenitorowe. Doniesienia te wskazują, że struktura trzpienia / progenitora homeostazy tkanki może hamować tworzenie się guza. Zjawisko to będzie wymagało potwierdzenia, ale należy o tym pamiętać podczas leczenia pacjentów strategiami takimi jak chemioterapia i / lub radioterapia.
2.2.3. p53 i zatrzymanie cyklu komórkowego
Białko p53 hamuje tworzenie się guza nie tylko poprzez indukowanie apoptozy, ale także poprzez powodowanie zatrzymania cyklu komórkowego. W zależności od rodzaju stresu komórkowego p53 może indukować zatrzymanie G1 poprzez aktywację transkrypcji cyklinozależnego inhibitora kinazy p21. Ten proces jest dobrze znany i został dogłębnie zbadany. p53 reguluje również przejście G2 / M. Na przykład p53 może blokować wejście komórki w mitozę przez hamowanie Cdc2. Cdc2 musi wiązać się z cykliną B1, aby działać. Represja cykliny B1 przez p53 również zatrzymuje komórki w G2. Jednak przejściowy cykl komórkowy może nie prowadzić do eradykacji guza, ponieważ komórka o potencjale onkogennym, której nie można naprawić, może wznowić proliferację.
Dlatego drugi mechanizm, starzenie się komórek, może odgrywać ważną rolę w p53- supresja nowotworu za pośrednictwem. Starzenie się komórek to trwałe zatrzymanie cyklu komórkowego. Istnieje wiele doniesień dotyczących korelacji między rozwojem guza, p53 i starzeniem. Omówimy kilka z tych czynników z punktu widzenia terapii raka. Ras onkogenny wyrażany w komórkach pierwotnych człowieka i gryzoni powoduje starzenie się komórek. Proces ten jest spowodowany nagromadzeniem p53 i p16. Inaktywacja p53 lub p16 zapobiega starzeniu wywołanemu przez ras. Z raportu wynika, że starzenie się piwnic odgrywa ważną rolę w hamowaniu rozwoju nowotworów. Inaktywacja p53, która występuje w większości ludzkich nowotworów, umożliwia komórkom uniknięcie starzenia się piwnicy, co prowadzi do rozwoju guza na poziomie makropoziomowym.
Wydaje się, że p53 zapobiega przekształcaniu się zmian przednowotworowych w nowotwory złośliwe poprzez aktywację programów starzenia . Starzenie się komórek wywołane przez p53 jest ważne nie tylko dla zapobiegania rakowi, ale także dla efektu przeciwnowotworowego wywołanego przez jakiekolwiek dzikie p53 wprowadzone do ustalonych guzów.
Xue i in. skonstruowali mysi model raka wątroby z warunkowo regulowanym endogennym p53.Reaktywacja endogennego p53 w guzach z niedoborem p53 powoduje całkowitą regresję guza. Co ciekawe, pierwotną odpowiedzią na p53 nie była apoptoza, ale wywołanie programu starzenia się piwnicy. Ten program wywołał wrodzoną odpowiedź immunologiczną, która wyeliminowała guz z organizmu żywiciela.
Dokonaliśmy przeglądu dwóch ważnych ról p53 jako supresora nowotworów. Wśród różnych funkcji p53, apoptoza i starzenie się są głównymi mechanizmami odpowiedzialnymi za supresję guza. Jednak dokładny sposób, w jaki p53 określa, czy następuje aktywacja programu starzenia lub programu apoptozy, wciąż pozostaje do wyjaśnienia. To pytanie jest szczególnie ważne dla rozwoju terapii przeciwnowotworowej opartej na p53, w tym podejść w połączeniu z konwencjonalną chemioterapią. Większość konwencjonalnych środków chemioterapeutycznych eliminuje komórki rakowe poprzez ich zabijanie. Dlatego też, jeśli p53 wywołuje starzenie, a nie apoptozę, pojawi się konflikt. Rzeczywiście, donoszono, że niektóre typy raka piersi są chronione przed cytotoksycznymi środkami chemioterapeutycznymi przez endogenne p53.
W związku z tym istnieje wiele czynników, takich jak jakość i ilość stresu komórkowego, typ tkanki i mikrośrodowisko piwniczne, określ losy komórki. Vousden i Prives zaproponowali model, w którym decyzję między życiem a śmiercią można określić na podstawie rozmiaru obrażeń lub czasu trwania stresu. W ich modelu niski poziom stresu, który można naprawić, wywołuje reakcję naprawy / przeżycia DNA, podczas gdy wysoki poziom stresu, którego nie można naprawić, wywołuje reakcję apoptotyczną lub starzenia. Ta podwójna natura p53, zabójcy i ochraniacza, wskazuje na możliwość, że p53 może również działać jako promotor guza. Przeciwapoptotyczne działanie p53 może prowadzić do przeżycia uszkodzonych komórek, co może zwiększać prawdopodobieństwo transformacji złośliwej (ryc. 1).
2.3. Zastosowania terapii raka opartej na p53
Ponieważ większość, jeśli nie wszystkie, ludzkie raki są nosicielami zmienionego p53, koncepcja przywrócenia p53 w leczeniu raka jest bardzo atrakcyjna. Model zwierzęcy wykazał reaktywację p53 typu dzikiego, co skutkowało skuteczną regresją guza, w tym regresją chłoniaka i raka wątroby.
2.3.1. Reaktywacja zmutowanego p53
Istnieje klasa małych cząsteczek, które reaktywują funkcje typu dzikiego zmutowanego p53. PhiKan083 to pochodna karbazolu znaleziona podczas badań przesiewowych in silico struktury krystalicznej p53. Wiążąc zmutowany p53, PhiKan083 podnosi temperaturę topnienia zmutowanego p53, co powoduje reaktywację jego funkcji. PRIMA-1 to kolejna mała cząsteczka zidentyfikowana przez przeszukiwanie komórek, która przywróciła specyficzne dla sekwencji wiązanie DNA i aktywną konformację p53. CP-31398 jest również małą cząsteczką, która może przywrócić fałdowanie białka zmutowanego p53 do bardziej naturalnej konformacji, która umożliwia funkcje typu dzikiego.
2.3.2. Stabilizacja p53
MDM2 jest ligazą ubikwityny E3, która kontroluje degradację p53. Wiele guzów wykazuje nadekspresję MDM2, nawet guzy bez mutacji p53. Celowanie w MDM2 w celu stabilizacji p53 wydaje się obiecujące, dlatego opublikowano wiele raportów dotyczących kierowania MDM2 lub MDM2-p53.
Na przykład nutliny są związkami cis-imidazolinowymi, które działają jako antagoniści MDM2- interakcja p53. Analiza struktury kryształu wykazała, że nutlin wiąże się w kieszeni MDM2, aby zapobiec oddziaływaniu p53-MDM2. Nutlin może aktywować szlak p53, indukując w ten sposób komórki rakowe i guzy ksenoprzeszczepów u myszy do zatrzymania cyklu komórkowego, apoptozy i hamowania wzrostu.
MI-219 to kolejna mała cząsteczka, która hamuje oddziaływanie MDM2-p53. MI-219 aktywuje również szlak p53 w komórkach z p53 typu dzikiego. W guzach ksenoprzeszczepów obserwowano apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego, co skutkowało regresją guza.
Jednak hamowanie MDM2 i aktywacja p53 w normalnej tkance mogą być szkodliwe. Ringshausen i in. wykazali, że p53 jest spontanicznie aktywowany w wielu tkankach myszy z niedoborem MDM2.Ponadto p53 wywołał śmiertelne patologie, w tym ablację klasycznie wrażliwych na promieniowanie tkanek.
2.3.3. Inne klasy leków do stabilizacji p53
Tenovin został znaleziony przez badanie przesiewowe leków na komórkach w celu aktywacji p53. Tenovina działa jako inhibitor aktywności deacetylacji białek SirT1 i SirT2. Wykazano, że dootrzewnowe podawanie tenoviny-6 wywołuje regresję guzów ksenoprzeszczepów w trybie myszy.
Issaeva i in. przeszukali bibliotekę chemiczną i odkryli małą cząsteczkę RITA (reaktywacja p53 i indukcja apoptozy komórek nowotworowych), która wiąże się z p53 i hamuje interakcję p53-MDM2 zarówno in vitro, jak i in vivo. RITA indukował apoptozę w różnych komórkach nowotworowych, które zachowały p53 typu dzikiego. Odkryli również, że p53 uwalniany z MDM2 przez RITA promuje p21 i hnRNP K (kofaktor p53), co sugeruje, że p21 odgrywa główną rolę w regulowaniu losu komórki rakowej po reaktywacji p53 (Rysunek 2).
2.4. Hamowanie p53 w terapii raka
Hamowanie p53 może chronić normalne komórki podczas chemioterapii genotoksycznej lub radioterapii. Skutki uboczne terapii genotoksycznej raka są w dużej mierze spowodowane apoptozą, w której pośredniczy p53. Małocząsteczkowa pifithrin-alfa może blokować aktywność transkrypcyjną zależną od p53 i chronić myszy przed śmiertelnymi skutkami ubocznymi związanymi z leczeniem przeciwnowotworowym. Jeśli uda nam się uniknąć ograniczającego dawkę stresu genotoksycznego dla normalnych komórek podczas chemioterapii lub radioterapii raka, pozwoli to na zastosowanie wyższej dawki u pacjentów, którzy nie reagują wystarczająco na konwencjonalną chemioterapię.
2.5. Terapia genowa p53
Pierwsza terapia genowa oparta na p53 została opisana w 1996 roku. Wektor retrowirusowy zawierający gen p53 typu dzikiego pod kontrolą promotora aktyny wstrzyknięto bezpośrednio do guzów pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc . Po opracowaniu rekombinowanego wirusa p53 z defektem replikacji (Ad5CMV-p53) przeprowadzono wiele badań klinicznych, w tym jedno z udziałem pacjentów z rakiem przełyku. Kilka prób osiągnęło fazę III, ale ostateczna zgoda FDA nie została jeszcze przyznana. Ostatnio w Chinach rozwija się terapia genowa oparta na p53.
2.6. Immunoterapia oparta na p53
Swoisty antygen cytotoksyczny limfocyt T związany z nowotworem może pośredniczyć w odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko rakowi in vivo. Białko P53, szczególnie ukierunkowane na mutację missense w p53, może być kandydatem na antygen nowotworowy. Niektórzy pacjenci z rakiem mają przeciwciała przeciwko p53, częstotliwość i znaczenie kliniczne są nadal przedmiotem dyskusji.
Speetjens i in. opisali badania kliniczne szczepionki z długim syntetycznym peptydem specyficznym dla p53 (p53-SLP) dla pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego. Dziesięciu pacjentów zostało zaszczepionych p53-SLP w badaniu fazy I i fazy II. Toksyczność była tolerowana, a odpowiedź immunologiczną specyficzną dla p53 wykryto u 9 z 10 pacjentów. Specyficzna dla P53 reaktywność limfocytów T utrzymywała się przez ponad 6 miesięcy u 6 z 9 pacjentów. Chociaż badanie było w fazie I / II, korzyści kliniczne mogą być trudne do uzyskania, ponieważ większość pacjentów miała komórki pomocnicze T pozbawione kluczowych cytokin. Donoszono o przedklinicznym badaniu I / II fazy INGN-225 (Introgen), szczepionki z komórkami dendrytycznymi wywołanej przez adenowirusy zmodyfikowanej p53 dla pacjentów z drobnokomórkowym rakiem płuca (SCLC). INGN-225 był dobrze tolerowany i indukował odpowiedź immunologiczną swoistą dla p53 u 18/43 (41,8%) pacjentów i uwrażliwiał SCLC na późniejszą chemioterapię.
3. Wniosek
W tym artykule skupiliśmy się na funkcjach p53 i zastosowaniach klinicznych ukierunkowanych na p53 w leczeniu raka. Jednak pomimo ostatnich postępów w badaniach nad funkcją cytoplazmatyczną białka p53, wydaje się, że różne role pozostają do wyjaśnienia, inne niż jego funkcja jako czynnika jądrowego. Doniesiono, że p53 indukuje apoptozę niezależnie od transkrypcji genów już w 1994 roku. Zaskakująco, aktywowany p53 może indukować apoptozę w cytoplazmie poprzez mechanizm zależny od bax.
Te doniesienia wskazują, że cytoplazmatyczne p53 może aktywować program apoptozy niezależny od transkrypcji. Dlatego należy opracować następną generację podejść do leczenia raka opartych na p53, aby wykorzystać tę funkcję cytozolową. Może to być bezpieczniejsze niż regulowanie modulacji transkrypcji p53 typu dzikiego, które może wywoływać zarówno efekty przeżycia, jak i proapoptotyczne w komórkach nowotworowych, jak omówiono powyżej.
Ostatnie doniesienia wykazały, że p53 reguluje proces samo- odnowienie nerwowych komórek macierzystych i hematopoetycznych komórek macierzystych. Model macierzysty raka podkreśla, że guzy są utrzymywane przez niewielką populację rakowych komórek macierzystych, które mogą dzielić się zarówno symetrycznie, jak i asymetrycznie. Utrata p53 sprzyja ostrej białaczce szpikowej poprzez nieprawidłową samoodnawianie.
Doniesiono, że komórki macierzyste sutka z ukierunkowaną mutacją p53 wykazują te same właściwości co rakowe komórki macierzyste. Reaktywacja p53 przywróciła asymetryczny podział komórek macierzystych raka i zahamowała wzrost guza. W rezultacie dalsze badanie związku między funkcją p53 a nowotworowymi komórkami macierzystymi może być jednym z najważniejszych obszarów badawczych do odkrywania nowych paradygmatów w leczeniu raka.