Resumo

TP53, codificando p53, é um dos genes supressores de tumor mais famosos. A maioria dos cânceres humanos demonstra a inativação da via do p53. O p53 mutante não apenas, não mais funciona como um supressor de tumor, mas também pode exercer efeitos promotores de tumor. A função básica do p53 é responder ao estresse celular. Aqui, revisamos os avanços recentes na pesquisa de p53 e enfocamos a apoptose, a parada do ciclo celular e a senescência em resposta ao estresse. Também revisamos as aplicações clínicas da terapia baseada em p53 para o câncer humano.

1. Introdução

O gene TP53, que codifica o p53, é um dos genes com mutação mais frequente em cânceres humanos. É relatado que aproximadamente metade de todos os cânceres têm p53 inativado. A proteína p53 tem uma ampla gama de funções biológicas, incluindo regulação do ciclo celular, apoptose, senescência, metabolismo do DNA, angiogênese, diferenciação celular e a resposta imune. Numerosas publicações relataram várias funções do p53, incluindo papéis transcricionais, pós-transcricionais e pós-traducionais.

Neste artigo, iremos nos concentrar em questões relacionadas ao p53 e à aplicação de terapias contra o câncer baseadas em p53. Conforme revisado por Vousden e Prives, as principais funções do p53 são a regulação da parada do crescimento e apoptose.

2. Funções normais de p53

Numerosos estudos mostraram que o p53 é um fator de transcrição que tem como alvo muitos genes e microRNAs em resposta ao estresse celular. O papel principal do p53 como supressor de tumor é bloquear a progressão do ciclo celular e / ou induzir a apoptose, em resposta a estresses celulares, como danos ao DNA. A atividade prejudicada do p53 promove o acúmulo de danos ao DNA nas células, o que leva a um fenótipo de câncer. Como um fator de transcrição, o p53 forma uma rede reguladora de genes diversa e complexa. Tem havido extensa investigação para esclarecer as sequências alvo que o p53 reconhece, o elemento de resposta do p53 (RE), como recentemente revisado por Riley et al. O p53 tem uma ampla gama de atividades biológicas, então esta revisão se concentrará no papel do p53 como supressor de tumor e suas implicações para a terapia do câncer.

2.1. Cânceres humanos e mutações de p53

A frequência da mutação TP53 varia de ~ 10% (neoplasias hematopoéticas) a 50–70% (neoplasias ovarianas, colorretais e de cabeça e pescoço). A mutação da linha germinativa de TP53 causa a síndrome de Li-Fraumeni, que é uma síndrome de câncer familiar que inclui câncer de mama, sarcoma de tecidos moles e vários outros tipos de câncer. A maioria das mutações TP53 em cânceres humanos resulta em mutações dentro do domínio de ligação ao DNA, evitando assim que o p53 transcreva seus genes alvo. No entanto, o mutante p53 não só levou a uma perda da função normal da proteína do tipo selvagem, mas também levou a novas habilidades para promover o câncer. O primeiro relato deste ganho de função por p53 mutante foi a observação de que a transfecção de p53 mutante em células nulas de p53 aumenta a formação de tumor em camundongos. Numerosos estudos subsequentes confirmaram esse achado.

2.2. p53 como um supressor de tumor

2.2.1. p53 como um sensor de danos ao DNA

A instabilidade genética é uma das características mais proeminentes dos tumores malignos. Existem sistemas muito sofisticados para detectar danos no DNA e reparar o genoma. O p53 desempenha um papel importante em tais sistemas “zeladores”. Quando o p53 responde a danos no DNA, ele provoca a interrupção do ciclo celular ou apoptose.

Foi demonstrado em 1991 que a indução de p53 de tipo selvagem pode induzir a apoptose. em células de leucemia. Os camundongos que têm um mutante de p53 específico não têm a capacidade de induzir a parada do ciclo celular, mas retêm a capacidade de induzir apoptose, o que lhes permite suprimir com eficiência os tumores induzidos por oncogene, sugerindo assim que a função pró-apoptótica de p53 pode desempenhar um papel mais papel importante em seus efeitos antitumorais do que em sua indução de parada do ciclo celular.

2.2.2. p53 e apoptose

Numerosos relatórios descreveram o mecanismo pelo qual p53 induz a apoptose. funciona principalmente como um fator de transcrição, é importante explorar os genes regulados por p53 que contribuem para a regulação da apoptose. Os primeiros estudos mostraram que o p53 de tipo selvagem pode se ligar à região promotora do gene bax e regular a transcrição do gene bax. bax é um membro do Bc família l-2, que forma heterodímeros com Bcl-2, inibindo sua atividade. A família de proteínas Bcl-2 desempenha um papel importante na apoptose e no câncer. Por exemplo, Bcl-2 controla a liberação de citocromo c da mitocôndria, que ativa a via apoptótica pela ativação da caspase 9. A caspase 9 então ativa a caspase 3 do carrasco. Ambas as caspases desempenham papéis importantes na via apoptótica.

Vários cânceres humanos, incluindo câncer de cólon e estômago, alteraram a expressão de Bcl-2. No entanto, a importância do nível de expressão de Bcl-2 no prognóstico de pacientes com câncer ainda está sendo investigada.A contribuição da expressão de bax para o prognóstico de pacientes com câncer e a resposta à terapia também não é clara. No câncer de mama, um estudo mostrou que um baixo nível de expressão de bax está associado a um mau prognóstico, enquanto outros relatórios não mostraram correlação entre o nível de expressão de bax e o prognóstico. Portanto, pesquisas adicionais serão necessárias.

CD95 (também chamado de Fas e Apo-1) é um “receptor de morte”, indicando seu papel principal na apoptose. O primeiro relatório de CD95 mostrou que um anticorpo anti-CD95 reduziu o crescimento de tumores de xenoenxerto de células B humanas. Desde então, vários relatórios foram publicados sobre a via de sinalização induzida por CD95 na apoptose. Agentes citotóxicos, como drogas quimioterápicas, podem induzir apoptose em células sensíveis a drogas. Portanto, é importante esclarecer quais vias de sinalização contribuem mais para a apoptose. Elucidar essas informações seria útil para a descoberta de drogas.

Vários relatórios indicaram que a via de CD95 desempenha um papel importante na apoptose induzida por agentes citotóxicos, e que este sistema envolve a ativação do p53 de tipo selvagem. Portanto, o status do p53 pode influenciar a quimiossensibilidade via sinalização de CD95. No entanto, um relatório recente indicou que o CD95 pode promover o crescimento do tumor. A morte celular programada é muito complicada de depende de uma variedade de fatores.

Existe uma subfamília Bcl-2 que contém apenas o domínio BH3. Várias proteínas BH3-only foram identificadas, e p53 atua como um fator de transcrição para PUMA e NOXA, que pertencem a esta classe. PUMA também é um mediador chave da via apoptótica induzida por p53.

Quando PUMA é interrompido em células de câncer de cólon, a apoptose induzida por p53 é evitada. PUMA pode desempenhar um papel fundamental na determinação do destino celular (morte celular programada versus parada do ciclo celular) em resposta à ativação de p53. Um relatório sobre camundongos nocaute para PUMA mostrou que nocaute de PUMA recapitula a deficiência apoptótica observada em camundongos nocaute para p53. PUMA é um mediador essencial para a apoptose dependente e independente de p53 in vivo. Como evitar a apoptose é uma das marcas do câncer, PUMA também pode desempenhar um papel importante durante a carcinogênese.

Relatórios recentes mostraram, entretanto, que em certas situações, a apoptose pode promover a carcinogênese. Michalak et al. e Labi et al. mostraram que a perda de PUMA ablacionou a linfomagenesia tímica induzida por radiação gama. As células-tronco hematopoéticas deficientes em PUMA são protegidas da morte celular induzida por irradiação gama, o que reduz a proliferação e replicação compensatórias. Por outro lado, camundongos do tipo selvagem experimentam morte celular massiva quando recebem irradiação gama, o que posteriormente leva ao repovoamento da região por células-tronco / progenitoras. Estes relatórios indicam que a estrutura da haste / progenitor do tecido homeostase pode suprimir a formação de tumor. Este fenômeno precisará ser confirmado, mas deve ser mantido em mente ao tratar pacientes com estratégias como quimioterapia e / ou radiação.

2.2.3. p53 e parada do ciclo celular

A proteína p53 suprime a formação de tumor não apenas induzindo apoptose, mas também causando parada do ciclo celular. Dependendo do tipo de estresse celular, o p53 pode induzir a parada em G1 por meio da ativação da transcrição do inibidor da quinase dependente de ciclina p21. Este processo é bem conhecido e extensivamente estudado. p53 também regula a transição G2 / M. Por exemplo, o p53 pode bloquear a entrada da célula na mitose pela inibição de Cdc2. O Cdc2 precisa se ligar à ciclina B1 para funcionar. A repressão da ciclina B1 por p53 também detém células em G2. No entanto, o ciclo celular transitório pode não levar à erradicação do tumor, porque uma célula com potencial oncogênico que não pode ser reparado pode retomar a proliferação.

Portanto, o outro mecanismo, a senescência celular, pode desempenhar um papel importante no p53- supressão tumoral mediada. A senescência celular é a parada permanente do ciclo celular. Existem muitos relatos sobre a correlação entre o desenvolvimento do tumor, p53 e senescência. Discutiremos alguns desses fatores do ponto de vista da terapia do câncer. O ras oncogênico expresso em células primárias humanas e de roedores resulta em senescência celular. Esse processo é devido ao acúmulo de p53 e p16. A inativação de p53 ou p16 evita a senescência induzida por ras. Este relatório implica que a senescência celular tem um papel importante na supressão do desenvolvimento do tumor. A inativação de p53, como está presente na maioria dos cânceres humanos, permite que as células evitem a senescência celular, resultando assim no desenvolvimento de tumor em nível macroscópico.

O p53 também parece impedir que lesões pré-malignas se desenvolvam em tumores malignos ativando programas de senescência . A senescência celular induzida por p53 é importante não apenas para a prevenção do câncer, mas também para o efeito anticâncer induzido por qualquer p53 de tipo selvagem introduzido em tumores estabelecidos.

Xue et al. construiu um modelo de câncer de fígado em camundongo com p53 endógeno regulado condicionalmente.A reativação de p53 endógeno em tumores com deficiência de p53 resulta em regressões tumorais completas. Curiosamente, a resposta primária ao p53 não foi apoptose, mas a indução de um programa de senescência celular. Este programa desencadeou uma resposta imune inata que eliminou o tumor do hospedeiro.

Revisamos dois papéis importantes do p53 como supressor de tumor. Dentre as várias funções do p53, a apoptose e a senescência são os principais mecanismos responsáveis pela supressão tumoral. No entanto, precisamente como o p53 determina se ocorre ou não a ativação do programa de senescência ou apoptose ainda não foi elucidado. Esta questão é especialmente importante para o desenvolvimento da terapia do câncer baseada em p53, incluindo abordagens em combinação com a quimioterapia convencional. A maioria dos agentes quimioterápicos convencionais consegue a eliminação das células cancerosas matando-as. Portanto, se o p53 induzir senescência em vez de apoptose, surgirá um conflito. Na verdade, foi relatado que alguns tipos de câncer de mama são protegidos de agentes quimioterápicos citotóxicos por p53 endógeno.

Portanto, vários fatores, como a qualidade e a quantidade de estresse celular, o tipo de tecido e microambiente da adega, determine o destino da célula. Vousden e Prives propuseram um modelo em que a decisão entre a vida e a morte pode ser determinada pela extensão do dano ou pela duração do estresse. Em seu modelo, um baixo nível de estresse que pode ser reparado provoca uma resposta de reparo / sobrevivência do DNA, enquanto um alto nível de estresse que não pode ser reparado induz uma resposta apoptótica ou de senescência. Esta dupla natureza do p53, assassino e protetor, indica a possibilidade de o p53 também atuar como promotor do tumor. A função antiapoptótica de p53 pode levar à sobrevivência de células danificadas, o que pode aumentar a possibilidade de transformação maligna (Figura 1).

Figura 1

Vousden e Prives propuseram um modelo do mecanismo duplo da função do p53 em tumores. O resultado da ativação do p53 depende de múltiplas variáveis. Nesse modelo, a resposta do p53 ao baixo estresse resulta em parada do ciclo celular, inibição do crescimento, reparo do DNA e assim por diante. Essa resposta permite que as células restaurem o dano induzido pelo estresse celular. Mas quando as células recebem alto estresse que não pode ser restaurado, o p53 atua como um assassino que pode induzir a apoptose ou senescência, evitando a proliferação de células defeituosas. Se o p53 responder erroneamente como um protetor quando as células recebem um alto estresse que não pode ser reparado, as células mantêm o dano genético, que pode levar ou contribuir para a progressão do câncer (linha pontilhada).

2.3. Aplicações da terapia do câncer baseada em p53

Como a maioria, senão todos, os cânceres humanos abrigam p53 alterado, o conceito de restauração de p53 para terapia do câncer é muito atraente. Um modelo animal mostrou a reativação de p53 de tipo selvagem para resultar em regressão tumoral eficiente, incluindo regressão de linfoma e carcinoma hepático.

2.3.1. Reativando o p53 mutante

Existe uma classe de pequenas moléculas que reativam as funções de tipo selvagem do p53 mutante. PhiKan083 é um derivado de carbazol encontrado na triagem in silico da estrutura cristalina de p53. Ao se ligar ao p53 mutado, PhiKan083 aumenta a temperatura de fusão do p53 mutado, o que resulta na reativação de sua função. PRIMA-1 é outra pequena molécula identificada por triagem baseada em células que restaurou a ligação de DNA específica da sequência e a conformação ativa de p53. CP-31398 também é uma pequena molécula que pode restaurar o enovelamento da proteína de p53 mutado para uma conformação mais natural que permite uma função de tipo selvagem.

2.3.2. Estabilização de p53

MDM2 é uma ubiquitina ligase E3 que controla a degradação de p53. Muitos tumores superexpressam MDM2, até mesmo tumores sem mutações no p53. Direcionar MDM2 para estabilização de p53 parece ser promissor, então muitos relatórios sobre direcionamento de MDM2 ou MDM2-p53 foram publicados.

Por exemplo, os nutlins são compostos cis-imidazolina que agem como antagonistas do MDM2- interação de p53. A análise da estrutura cristalina mostrou que nutlin se liga no bolso do MDM2 para prevenir a interação p53-MDM2. Nutlin pode ativar a via do p53, induzindo células cancerosas e tumores de xenoenxerto em camundongos a sofrer parada do ciclo celular, apoptose e inibição do crescimento.

MI-219 é outra pequena molécula que inibe a interação MDM2-p53. MI-219 também ativa a via p53 em células com p53 de tipo selvagem. Apoptose e parada do ciclo celular foram observadas em tumores de xenoenxerto, o que resultou na regressão do tumor.

No entanto, a inibição do MDM2 e a ativação do p53 no tecido normal podem ser prejudiciais. Ringshausen et al. mostraram que o p53 é ativado espontaneamente em muitos tecidos em camundongos deficientes em MDM2.Além disso, o p53 desencadeou patologias fatais que incluíram a ablação de tecidos classicamente radiossensíveis.

2.3.3. Outras classes de medicamentos para a estabilização do p53

Tenovin foi encontrado por uma triagem de drogas baseada em células para ativar o p53. Tenovin atua como um inibidor das atividades de desacetilação de proteínas de SirT1 e SirT2. A administração intraperitoneal de tenovin-6 demonstrou induzir uma regressão de tumores de xenoenxerto em um modo de camundongo.

Issaeva et al. rastrearam uma biblioteca química e encontraram a pequena molécula RITA (reativação de p53 e indução de apoptose de células tumorais), que se liga a p53 e inibe a interação p53-MDM2 tanto in vitro quanto in vivo. RITA induziu apoptose em várias células cancerosas que retinham o p53 de tipo selvagem. Eles também descobriram que o p53 liberado de MDM2 por RITA promove p21 e hnRNP K (um cofator de p53), implicando assim que p21 desempenha um papel importante na regulação do destino da célula cancerosa após a reativação de p53 (Figura 2).

Figura 2

Estratégias para Estabilização de p53 e reativação de p53 mutante.

2.4. Inibição de p53 para terapia do câncer

A inibição de p53 pode proteger células normais durante quimioterapia genotóxica ou radioterapia. Os efeitos colaterais da terapia genotóxica para o câncer são amplamente causados pela apoptose mediada por p53. A pequena molécula pifitrina-alfa pode bloquear a atividade transcricional dependente de p53 e proteger camundongos dos efeitos colaterais letais associados ao tratamento anticâncer. Se pudermos evitar o estresse genotóxico limitante de dose para células normais durante a quimioterapia ou radioterapia para câncer, isso permitirá que uma dose mais elevada seja usada para pacientes que não respondem suficientemente à quimioterapia convencional.

2.5. Terapia gênica p53

A primeira terapia gênica baseada em p53 foi relatada em 1996. Um vetor retroviral contendo o gene p53 de tipo selvagem sob o controle de um promotor de actina foi injetado diretamente em tumores de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas . Após o desenvolvimento de um vírus p53 recombinante com replicação deficiente (Ad5CMV-p53), muitos ensaios clínicos foram realizados, incluindo um em pacientes com câncer de esôfago. Alguns testes alcançaram a fase III, mas a aprovação final do FDA ainda não foi concedida. Recentemente, a terapia gênica baseada em p53 tem sido desenvolvida na China.

2.6. Imunoterapia baseada em p53

Linfócito T citotóxico específico de antígeno associado a tumor pode mediar a resposta imune do hospedeiro contra o câncer in vivo. A proteína P53, especialmente direcionada à mutação missense de p53, pode ser candidata ao antígeno tumoral. Alguns pacientes com câncer têm anticorpos contra o p53, a frequência e o significado clínico ainda estão em debate.

Speetjens et al. relataram ensaios clínicos de uma vacina de peptídeo sintético longo específico de p53 (p53-SLP) para pacientes com câncer colorretal metastático. Dez pacientes foram vacinados com p53-SLP em um estudo de Fase I e Fase II. A toxicidade foi tolerável e a resposta imune específica para p53 foi detectada em 9 de 10 pacientes. A reatividade das células T específicas para P53 persistiu mais de 6 meses em 6 de 9 pacientes. Embora o estudo tenha sido de Fase I / II, o benefício clínico pode ser difícil de obter porque a maioria dos pacientes tinha células T auxiliares sem citocinas-chave. Foi relatado o ensaio pré-clínico de fase I / II do INGN-225 (Introgen), uma vacina de células dendríticas induzida por adenovírus modificada por p53 para pacientes com câncer de pulmão de pequenas células (SCLC). INGN-225 foi bem tolerado e induziu resposta imune específica de p53 em 18/43 (41,8%) pacientes e SCLC sensibilizado para quimioterapia subsequente.

3. Conclusão

Neste artigo, nos concentramos nas funções do p53 e nas aplicações clínicas direcionadas ao p53 para a terapia do câncer. No entanto, apesar dos avanços recentes na pesquisa sobre a função citoplasmática do p53, parece que várias funções ainda precisam ser elucidadas além de sua função como um fator nuclear. Foi relatado que o p53 induz a apoptose independente de sua transcrição de genes já em 1994. Surpreendentemente, o p53 ativado pode induzir apoptose no citoplasma por um mecanismo dependente de bax.

Esses relatórios indicam que o p53 citoplasmático pode ativar um programa apoptótico independente da transcrição. A próxima geração de abordagens terapêuticas de câncer baseadas em p53 deve, portanto, ser desenvolvida para tirar proveito dessa função citosólica. Isso pode ser mais seguro do que regular a modulação da transcrição de p53 de tipo selvagem, que pode induzir efeitos pró-sobrevivência e pró-apoptóticos em células tumorais, conforme discutido acima.

Relatórios recentes mostraram que p53 regula o processo de auto- renovação de células-tronco neurais e células-tronco hematopoiéticas. O modelo do tronco do câncer insiste que os tumores são mantidos por uma pequena população de células-tronco do câncer que podem se dividir simétrica e assimetricamente. A perda de p53 promove leucemia mieloide aguda por auto-renovação aberrante.

Foi relatado que as células-tronco mamárias com a mutação direcionada de p53 mostram as mesmas propriedades das células-tronco cancerosas. A reativação do p53 restaurou a divisão celular assimétrica das células-tronco cancerosas e induziu a inibição do crescimento do tumor. Como resultado, uma investigação mais aprofundada da ligação entre a função do p53 e as células-tronco do câncer pode, portanto, ser um dos campos de pesquisa mais importantes para descobrir novos paradigmas na terapia do câncer.