Método experimental

Assim como a fórmula usada para calcular a razão sinal-ruído pode ter um efeito dramático no sensibilidade aparente de qualquer conjunto de dados espectral específico, a configuração de hardware do instrumento e os parâmetros experimentais da aquisição de dados também têm um efeito dramático na qualidade do espectro adquirido.

Existem muitos parâmetros de hardware, configurações e opções que afetam a sensibilidade medida de um espectrofluorômetro. Isso pode tornar extremamente difícil comparar absolutamente a sensibilidade relativa de dois instrumentos diferentes, se eles não forem usados de maneira virtualmente idêntica. Abaixo, discutimos cada um desses fatores e o impacto que eles têm nos dados resultantes.

Aplicável a todos os fluorômetros de varredura

Comprimento de onda de excitação: O comprimento de onda de excitação deve ser idêntico para todos os sistemas sendo comparados. O método HORIBA usa excitação de 350 nm para a banda Raman da água, assim como a maioria dos outros fabricantes. Quando excitada em 350 nm, a banda de emissão Raman para água tem um pico em 397 nm.

É uma sorte que a maioria dos fabricantes padronizou esse comprimento de onda de excitação, pois permite uma melhor comparação. No entanto, é perfeitamente válido mover o comprimento de onda de excitação para qualquer outro valor como forma de testar a sensibilidade em uma faixa de comprimento de onda diferente (por exemplo, o NIR).

Faixa de varredura de emissão: O método HORIBA varre o monocromador de emissão de 365 a 450 nm, com incrementos de 0,5 nm, de modo a coletar todo o pico Raman em 397 nm e também o fundo em 450 nm.

Largura de banda (tamanho da fenda): O método HORIBA usa passagem de banda de 5 nm fendas nos espectrômetros de excitação e emissão. Alguns fabricantes especificam fendas de 10 nm que têm o efeito de aumentar a sensibilidade em comparação com 5 nm. Foi relatado que dobrar o tamanho da fenda física na entrada e saída de um monocromador pode quadruplicar a intensidade de excitação e a taxa de transferência de detecção de emissão, uma vez que a taxa de transferência vai como o quadrado do aumento de tamanho, mas esta é uma estimativa simplista que deve ser medida empiricamente. O HORIBA mediu a diferença do fator com o HORIBA Fluoromax e observou que, para o Fluoromax, dobrar o tamanho das fendas de 5 para 10 nm aumenta a relação sinal / ruído geral para a banda Raman da água por um fator de mais de 3 vezes. No entanto, isso será diferente para todos os fluorômetros, por isso, certifique-se de não comparar com passagens de banda idênticas.

Tempo de integração (ou tempo de resposta): Isso se refere a quanto tempo o detector pode coletar um sinal em um determinado posição da etapa do comprimento de onda. Ele também desempenha um papel significativo na sensibilidade geral medida para um fluorômetro. O método HORIBA usa um tempo de integração de 1 segundo em cada ponto de comprimento de onda, semelhante a outros fabricantes. No entanto, alguns fabricantes especificam um tempo de resposta de 2 segundos, o que aumenta a relação sinal-ruído geral em quase um fator de dois. Certifique-se de usar o mesmo tempo de integração (resposta) ao comparar.

Tipo de PMT: a maioria dos espectrofluorômetros usa um tubo fotomultiplicador (PMT) como seu único detector de emissão de fluorescência, sem qualquer opção para trocar a caixa do detector. Isso é verdade para a maioria dos fluorômetros analíticos de bancada. Alguns desses sistemas de bancada permitem a seleção de diferentes PMTs individuais com diferentes faixas de comprimento de onda e especificações. PMTs que não detectam tão longe no NIR quanto outros PMTs terão uma contagem de escuridão mais baixa, de modo que fornecerão uma melhor relação sinal-ruído na faixa de 350 a 400 nm, no entanto, podem não ser utilizáveis em todo o comprimento de onda de emissão intervalo desejado para um determinado laboratório. O PMT padrão da HORIBA usado nas séries de fluorômetros FluoroMax Plus, Fluorolog3 e QuantaMaster 8000, é o Hamamatsu R928P PMT, que é considerado o padrão da indústria para fluorometria. Nesses casos, certifique-se de que cada fluorômetro esteja usando o mesmo PMT, quando possível.

Filtros ópticos: Um filtro óptico pode ser adicionado ao caminho óptico de um fluorômetro, tanto no lado da excitação quanto no lado da emissão da amostra. Eles podem ser colocados manualmente em um suporte de filtro dentro do compartimento de amostra ou podem fazer parte de uma roda de filtro que pode colocar automaticamente diferentes filtros no caminho óptico quando diferentes protocolos experimentais são selecionados. Os filtros ópticos têm o efeito de melhorar a rejeição da luz difusa em determinados comprimentos de onda e podem melhorar drasticamente a relação sinal / ruído de um fluorômetro. A HORIBA não usa nenhum filtro óptico, exceto os próprios espectrômetros de varredura, ao especificar o SNR para Raman de água com as especificações das séries Fluoromax, Fluorolog3 ou QuantaMaster 8000.Ao comparar um fluorômetro HORIBA, com um fluorômetro que usa filtros automatizados, por favor, não use um filtro, ou se for automático, confirme que marca e tipo de filtros são usados, e onde eles são empregados, para replicar um método experimental semelhante com um fluorômetro HORIBA.

Aplicável a fluorômetros modulares de pesquisa

Tipo de detector: fluorômetros de pesquisa modulares normalmente incluem um invólucro PMT como padrão, mas permitem muitos tipos diferentes de detectores de canal único para estender o comprimento de onda ou intervalo de vida de fluorescência de um instrumento. Detectores alternativos incluem invólucros PMT resfriados, vários detectores de estado sólido, como InGaAs, MCP PMTs e assim por diante. Esses diferentes tipos de detectores terão efeitos dramáticos na relação sinal-ruído de qualquer medição de amostra em particular, então, aqui novamente, ao tentar comparar a sensibilidade de um fluorômetro com outro, certifique-se de que o mesmo tipo de detector seja usado para coletar dados sobre ambos os sistemas.

Temperatura do detector: a maioria dos espectrofluorômetros comerciais usa invólucros PMT que não são resfriados e, na verdade, muitos instrumentos nem mesmo oferecem a opção de detector resfriado. Um invólucro PMT resfriado pode melhorar a sensibilidade de um instrumento reduzindo as contagens escuras (fundo) em comparação com o mesmo PMT exato em um invólucro ambiente. As caixas PMT padrão da HORIBA no FluoroMaxPlus, Fluorolog3 e QuantaMaster 8000 são caixas PMT ambientais, no entanto, as séries Fluorolog3 e QuantaMaster 8000 oferecem caixas PMT resfriadas opcionais para melhorar a sensibilidade e a detecção NIR. Ao comparar fluorômetros de pesquisa modulares, certifique-se de comparar os dados coletados com o mesmo tipo de invólucro PMT (ambiente ou resfriado) e, se resfriado, também resfriado à mesma temperatura.

Monocromador Único Versus Duplo: Modular Os fluorômetros de pesquisa permitem que um pesquisador selecione monocromadores simples ou duplos no caminho óptico de excitação ou de emissão. Aqui, o termo monocromador duplo se refere a dois estágios de grade dispersiva, um após o outro, com uma fenda de entrada, fenda intermediária e fenda de saída. Um monocromador duplo pode ser configurado no modo aditivo ou dispersivo, mas, em qualquer caso, a taxa de transferência e as características de luz dispersa de um monocromador simples e duplo são muito diferentes e terão um grande impacto no SNR de uma varredura Raman de água, mesmo que as larguras de banda, tempos de integração e comprimentos de onda sejam mantidos constantes.

Densidade do sulco da grade: A densidade do sulco de uma grade também afetará o rendimento e, portanto, a sensibilidade de um espectrofluorômetro. Para a maioria dos espectrofluorômetros, isso não é um grande problema porque os sistemas são fabricados com apenas uma grade específica. Nesse caso, o mais importante é garantir que as passagens de banda sejam selecionadas para serem as mesmas. No entanto, para fluorômetros modulares, você pode configurar os monocromadores com grades diferentes ou grades múltiplas. Para esses sistemas, você deve ter muito cuidado para manter as coisas o mais semelhantes possível. Por exemplo, quando você tem dois instrumentos com espectrômetros de comprimento focal semelhantes, alterar a densidade do sulco da grade aumentará ou diminuirá a sensibilidade para a mesma configuração de passagem de banda de 5 nm. O método HORIBA usa grades com uma densidade de arvoredo de 1.200 sulcos por milímetro.

Ângulo de grade de chama: As grades selecionadas para um monocromador de excitação ou emissão fornecem um rendimento ideal em uma banda de comprimento de onda particular, conhecida como chama ângulo, uma vez que é determinado pelo ângulo de gravação da grade transmitido na superfície da grade. Como tal, um monocromador de excitação com um monocromador de excitação queimado de 350 nm e um monocromador de emissão de 400 nm, seriam as escolhas ideais para alcançar a melhor sensibilidade Raman de água quando excitado em 350 nm. Uma vez que a maioria dos fluorômetros não permitem que você ajuste a grade, esta variável não é um fator, mas para aqueles que permitem que você escolha grades, certifique-se de escolher grades com o mesmo ângulo de chama ou muito semelhante para fazer uma comparação válida .