Introdução

A transferência horizontal de genes (HGT) entre células bacterianas contribui para a adaptação bacteriana a vários ambientes e, a longo prazo, para a evolução bacteriana (Lorenz e Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas e Nielsen, 2005). No entanto, em ambientes humanos, causa disseminação indesejável de patogenicidade, resistência a antibióticos ou genes artificiais (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Três mecanismos de HGT em bactérias são geralmente aceitos: conjugação, transdução e transformação (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Conjugação e transdução envolvem aparelhos específicos para transferência de DNA de células doadoras para células receptoras; estes são vírions de pili e fago conjugativos, respectivamente. A transformação é principalmente uma função das células receptoras que expressam competência para absorver DNA extracelular nu.

A competência de transformação pode ser induzida natural ou artificialmente, mas nem todas as espécies bacterianas desenvolvem competência natural (Lorenz e Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). Em bactérias naturalmente transformáveis, a competência é geralmente transitória e induzida por alterações no estado de crescimento do organismo (Johnston et al., 2014). Um grupo de “genes de competência” foi identificado e modelos mecanísticos gerais foram propostos (Chen e Dubnau, 2004), embora os mecanismos precisos para espécies bacterianas individuais não tenham sido suficientemente elucidados (Cameron e Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz e Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska e Gerdes, 2015). Como a transformação requer DNA extracelular nu como substrato, a sensibilidade à DNase, que degrada o DNA nu, é fundamental para distinguir a transformação de outros Mecanismos HGT resistentes a DNase (Lorenz e Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa e Berenguer, 2015).

Em geral, Escherichia coli não é considerada naturalmente transformável; ela desenvolve alta competência genética apenas em condições artificiais, incluindo exposição a altas concentrações de Ca2 + e choque de temperatura (Mandel e Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polietilenoglicol tratar mento (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989), ou choque elétrico (Sambrook e Russell, 2006). No entanto, alegadamente, a E. coli pode expressar competência modesta sob certas condições que são viáveis em seus ambientes naturais (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . A seguir, definimos a transformação em que o plasmídeo foi adicionado externamente como transformação de plasmídeo (PT) e transformação em que o DNA do plasmídeo vem de células bacterianas mortas (do ambiente) como transferência horizontal de plasmídeo por transformação (HPTT).

Escherichia coli parece possuir múltiplos mecanismos de captação de DNA, incluindo dois populares: um que é dependente dos “genes de competência”, que comumente funcionam em muitas bactérias gram-negativas e positivas (Finkel e Kolter, 2001; Palchevskiy e Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha e Redfield, 2012; Seitz e Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska e Gerdes, 2015). Este mecanismo é conduzido principalmente pelo aparato molecular específico formado em torno da superfície celular estrutura, que passa através das membranas celulares apenas DNA de fita simples linear produzido usando uma nuclease periplasmática específica. Em E. coli, esses genes não são considerados como contribuindo para o PT porque o PT requer a absorção de duplo-s intacto DNA circular tranded (Sinha e Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Portanto, é improvável que esse mecanismo contribua para a PT no meio ambiente. O segundo mecanismo é aquele dependente de fatores ambientais externos, como íons metálicos divalentes, choque térmico e tensões físicas (Mandel e Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Esses estímulos são comumente considerados como indutores da formação de estruturas semelhantes a poros na superfície celular para a passagem de DNA de fita dupla intacto, incluindo plasmídeos circulares, embora os detalhes permaneçam obscuros (Reusch et al., 1986; Reusch e Sadoff, 1988; Huang e Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Os íons Ca2 + e Mg2 + são os fatores indutores de competência mais comuns. Habitats ambientais geralmente contêm vários milimolares desses íons, cujas concentrações são suficientes para induzir competência fraca, mas detectável em E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Portanto, esse mecanismo é possível no ambiente externo aos laboratórios. Além dos dois mecanismos acima, outro mecanismo foi proposto por Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015), e Sun (2016), no qual um transportador ABC e proteínas específicas periplasmáticas e de membrana interna estão envolvidos. Este mecanismo é regulado por reguladores transcricionais internos, RpoS e CRP, portanto, foi sugerido que este mecanismo também é um processo natural controlado geneticamente.

Nesta mini revisão, resumimos nossos estudos sobre HGT usando E. coli sistemas experimentais e discutir a possível ocorrência de transformação por múltiplos mecanismos em ambientes naturais e seu possível impacto na disseminação de genes de resistência a antibióticos.

Transformação de plasmídeo de E. coli em condições que imitam o ambiente natural

PT em extratos alimentares

Alimentos humanos são excelentes meios de cultura para muitas bactérias. No entanto, pouca atenção tem sido dada aos efeitos dos alimentos na fisiologia bacteriana além do crescimento e sobrevivência. Nós investigamos a possibilidade de que os alimentos atuem como meio para a transformação bacteriana. Os alimentos geralmente contêm concentrações milimolares de íons metálicos divalentes (Ca2 + e Mg2 +) e costumam ser armazenados em uma geladeira ou freezer seguido por rápido aquecimento (ou seja, choque térmico). Essas condições conduzem ao desenvolvimento da competência em E. coli (Mandel e Higa, 1970; Huang e Reusch, 1995; Baur et al., 1996); como E. coli é um contaminante alimentar comum, é interessante determinar se pode ser transformado em alimentos. Certos alimentos podem de fato atuar como meio que induz a competência em E. coli (Maeda et al., 2003). Das 42 amostras de alimentos testadas, > 10 exibiram a capacidade de induzir competência com uma frequência de 10−7−10−9. Entre estes, o sobrenadante do tofu (um alimento parecido com queijo feito de leite de soja coagulado) exibiu a maior atividade (um em 10−7−10−8 células receptoras), correspondendo a aproximadamente metade da eficiência obtida com 100 mM CaCl2. No entanto, não houve correlações claras entre as frequências de transformação e as características químicas dos alimentos (concentrações de Ca2 + ou Mg2 + e pH), sugerindo que fatores complexos dentro dos alimentos afetam o desenvolvimento de competências. Efeitos semelhantes de alimentos na indução de transformação foram relatados em E. coli (Bauer et al., 1999) e Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT em Solid-Air Biofilm

Muitas bactérias existem como biofilmes em ambientes naturais e artificiais (Davey e O’Toole, 2000). Biofilmes são agregados de micróbios que se formam em interfaces sólido-líquido ou sólido-ar (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). As células nessas culturas de alta densidade interagem umas com as outras e expressam funções fisiológicas distintas em comparação com suas formas planctônicas livres. Estudos anteriores sobre a transformação de E. coli focaram exclusivamente em células planctônicas (Mandel e Higa, 1970; Hanahan, 1983), mas mostramos que as células de E. coli em biofilmes SA desenvolvem competência em uma frequência de 10−6−10−8 em vários meio sólido, incluindo LB e H2O agar e vários alimentos úmidos (Maeda et al., 2004). As células vivas geralmente coexistem com células mortas em biofilmes, e as últimas podem liberar seu DNA e certos íons metálicos divalentes, incluindo Ca2 + e Mn2 +, no microambiente local do biofilme (Davey e O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ) Essas condições podem ser favoráveis ao desenvolvimento da transformação e não podem ser exclusivas dos biofilmes SA, uma vez que um aumento semelhante em biofilmes ar-líquido de E. coli também foi relatado (Król et al., 2011).

PT de cepas selvagens de E. coli em água

Nossos resultados e de outros sugerem que a E. coli ambiental pode adquirir DNA estranho por meio de transformação. No entanto, existem poucos relatórios anteriores de investigações sobre a transformabilidade de cepas naturais de E. coli (Woegerbauer et al., 2002; Sinha e Redfield, 2012). Portanto, examinamos o potencial das cepas naturais de E. coli para desenvolver competência em condições ambientais. Usamos uma coleção de cepas de referência de E. coli padrão (ECOR) como nosso modelo de E. coli natural (Ochman e Selander, 1984) porque essas cepas de ECOR têm sido amplamente utilizadas em vários estudos sobre a fisiologia, comportamento e variação genotípica de E. coli natural (Tenaillon et al., 2010). Descobrimos que algumas cepas ECOR exibiram transformabilidade detectável (10−10−10−11) em água natural (água pura natural engarrafada disponível comercialmente) em temperaturas constantes e variando entre 5 e 35 ° C e em temperaturas de inverno em um experimento de campo, sugerindo que a E. coli natural pode potencialmente desenvolver competência sob certas condições que podem ocorrer no ambiente (Matsumoto et al., 2016b).

Transferência horizontal de plasmídeo por transformação em E. coli

HPTT induzido por congelamento-descongelamento em águas naturais e extratos de alimentos

No ambiente, o DNA puro pode ser fornecido naturalmente de células mortas para células vizinhas dentro do mesmo habitat ou microambiente.Portanto, vale a pena investigar a possibilidade de HPTT em um sistema fechado sob algumas condições viáveis. O congelamento-descongelamento é um processo comum no manuseio de alimentos e também ocorre na natureza. O tratamento de congelamento-descongelamento de células de E. coli pode promover o vazamento de DNA de células mortas e subsequente captação pelas células sobreviventes, porque elas respondem ao choque térmico, resultando em transformação in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Este tratamento de suspensões condensadas de cepas mistas de E. coli em águas naturais e extratos alimentares causou transferência lateral in situ de plasmídeos não conjugativos a uma frequência de 10−8−10−10 (Ishimoto et al., 2008). Este fenômeno também ocorreu mesmo após 1–2 meses de armazenamento a −20 ° C, e sua sensibilidade à DNase demonstrou que ela foi mediada por um mecanismo de transformação.

Baixa frequência de HPTT em biofilmes SA

Acredita-se que os biofilmes sejam ambientes adequados para a transformação in situ porque as células vivas e mortas coexistem nas proximidades, e o DNA liberado das células mortas geralmente se acumula ao redor das células vivas. Além disso, como descrito acima, como as células de E. coli podem desenvolver competência modesta em biofilmes SA (Maeda et al., 2004), esses dois fatores contribuem para o HPTT em biofilmes. Simplesmente co-cultivando uma cepa livre de plasmídeo com uma contendo um plasmídeo não conjugativo em um biofilme SA em meio de ágar sem antibiótico, as células transformadas foram produzidas em baixa frequência (10−9−10−10) dentro de 24-48 h (Maeda et al., 2006). As culturas líquidas das mesmas cepas em caldo LB não produziram ou produziram poucos transformantes, sugerindo a importância da formação de biofilme SA para a transferência de plasmídeo. Essencialmente, o mesmo fenômeno ocorreu em biofilmes SA em mídia baseada em alimentos (Ando et al., 2009). Esse fenômeno também ocorreu entre cepas de laboratório populares, como DH5, HB101 e MG1655 (Etchuuya et al., 2011), que são livres de fagos lisogênicos e de aparatos conjugativos, sugerindo que a baixa frequência de transferência horizontal de plasmídeo em biofilmes SA pode ocorrem sem o auxílio de fago ou maquinário de conjugação e, portanto, que essa transferência de DNA se deve a uma espécie de transformação. No entanto, uma vez que a mutação rpoS− não afetou este HPTT (Maeda et al., 2006), é improvável que o mecanismo dependente de RpoS (Zhang et al., 2012) esteja envolvido.

Alta frequência de HPTT Induzido pelo Fago P1

Ao avaliar combinações de várias cepas e plasmídeos para transferência horizontal de plasmídeo, a cepa de E. coli CAG18439 foi encontrada para atuar tanto como um doador de plasmídeo quanto como receptor de plasmídeo em combinação com o plasmídeo pHSG299 e poderia freqüentemente transferir o plasmídeo em uma cultura celular mista, mesmo em meio líquido (Etchuuya et al., 2011). Este HGT demonstrou ser um tipo de transformação porque a transferência de plasmídeo de alta frequência (10−5−10−8) era sensível à DNase. Estudos posteriores revelaram que esse fenômeno apresenta algumas características específicas: (1) promoção por fator proteico liberado de CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) promoção por uma sequência de 88 bp em pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) alta frequência de transferência (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); e (4) dependência de genes específicos (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Com relação a (1), um estudo posterior revelou que esses fatores proteicos incluem uma partícula de fago P1vir (ou um derivado deste) e que o fago P1vir adicionado externamente pode reproduzir a transferência horizontal de plasmídeo entre células de E. coli e as três outras características principais de CAG18439 -dependente HPTT (Sugiura et al., 2017). Este fenômeno também foi amplamente sensível à DNase, sugerindo que uma grande parte dessa transferência de plasmídeo se deve à transformação, apesar do envolvimento do fago P1. O mecanismo de transformação da transferência de plasmídeo induzida por fago P1vir pode ser devido à infecção de fago ou despertar espontâneo de fago lisogenizado em células que abrigam plasmídeo, levando à lise celular e subsequente liberação de DNA de plasmídeo intracelular em uma forma utilizável para transformação. Embora esse mecanismo seja geralmente viável, houve poucas demonstrações claras dele em E. coli. Um estudo recente de Keen et al. (2017) usando outro sistema de fago também demonstrou um mecanismo de transformação induzida por fago semelhante em E. coli. No entanto, HPTT por P1vir ou CAG18439 não pode ser explicado adequadamente apenas pelo fornecimento de DNA aprimorado da lise celular induzida por fago, e difere da transformação simples em E. coli (Hanahan, 1983) em termos de suas características distintas (2–4). Em relação a (2), a sequência de 88 pb em pHSG299 não é homóloga à parte da sequência do genoma do fago P1. Esta sequência é freqüentemente encontrada em bancos de dados entre sequências gerais de vetores de clonagem, mas não em qualquer fonte natural. Rastreando o processo de construção de pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), no entanto, suspeitamos que a sequência de 88 bp se origina de R6-5, um plasmídeo R conjugativo.Esta sequência, e elementos de DNA semelhantes, podem contribuir para HPTT de R e outros plasmídeos no ambiente. Com relação a (3), esta transferência de alta frequência não pode ser explicada pela capacidade de PT simples de CAG18439 e outras cepas usadas porque PT simples nessas cepas sob a condição de cultura equivalente foi 105-102 vezes menos frequente (Etchuuya et al., 2011). Foi, portanto, sugerido que um fator proteico derivado de CAG18439, com tamanho estimado entre 9 e 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) também poderia estar envolvido na promoção de HPTT. Este fator presumivelmente auxilia na captação de DNA pelas células receptoras, provavelmente em combinação com a seqüência de 88 pb no DNA em transformação. Por último, com relação a (4), estudos posteriores de triagem de todo o genoma para genes receptores envolvidos em HPTT sugeriram que vários genes participam do mecanismo (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ) Estes incluem aqueles que não foram relatados como envolvidos na transformação natural ou artificial em E. coli (como rodZ) e alguns homólogos de genes de competência conhecidos, como ybaV e yhiR (Finkel e Kolter, 2001; Palchevskiy e Finkel, 2006 ), mas não inclui rpoS e outros genes relacionados ao mecanismo dependente de RpoS (Zhang et al., 2012). No geral, esses resultados apontam para um mecanismo complexo desconhecido de HPTT de alta frequência induzido por fago que pode compartilhar parcialmente a via de transformação natural.

HPTT entre cepas naturais de E. coli

Para avaliar melhor a generalidade e a variedade de HPTT em cepas de E. coli, cepas naturais (as cepas ECOR mencionadas acima) foram usadas em um estudo de HPTT. Várias combinações de cepas de ECOR foram co-cultivadas em meio líquido, resultando em transferência horizontal sensível a DNase de genes naturais de resistência a antibióticos (Matsumoto et al., 2016a, b). O isolamento de plasmídeo desses novos transformantes demonstrou transferência horizontal de plasmídeo entre as cepas ECOR (Matsumoto et al., 2016a, b). Experimentos de PT simples usando as mesmas cepas ECOR revelaram que HPTT ocorre com muito mais frequência (10−6−10−8) do que PT simples (abaixo de 10−10) nas mesmas condições de cultura, o que sugere que HPTT é único e eficaz. Além disso, descobrimos que 6 das 12 combinações das cepas ECOR, algumas das quais não produzem fagos formadores de placas (Shibata et al., 2014b), exibiram transferência de genes sensíveis à DNase, levando-nos a suspeitar que o HPTT é bastante comum no natural Estirpes de E. coli. No geral, esses dados sugerem que algum mecanismo (s) de transformação livre de fago e de conjugação também existem naturalmente em algumas cepas de E. coli e que HPTT de plasmídeos naturais resistentes a antibióticos (tais como plasmídeos da cepa ECOR24: Nº de Acesso AB905284 e AB905285) pode ser um caminho para a produção de células de E. coli naturais multirresistentes.

Possíveis mecanismos e viabilidade de PT e HPTT em E. coli no ambiente

Exemplos de PT e O HPTT induzido por congelamento-descongelamento e de baixa frequência introduzidos nesta mini-revisão estão provavelmente mais relacionados ao mecanismo de formação de poros do que ao mecanismo dependente do gene da competência, porque alimentos e águas naturais geralmente contêm níveis mM de íons Ca2 + e Mg2 + (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003), e o ambiente de biofilme fornece células vivas com o conteúdo de células mortas, incluindo íons metálicos divalentes e DNA plasmídico transformável. Conforme descrito anteriormente (Maeda et al., 2006), um biofilme SA (diâmetro, 10–12 mm; espessura, 0,5–0,8 mm) contém aproximadamente 2–5 × 109 células. Além disso, as bactérias intestinais em mamíferos geralmente somam aproximadamente 1011 células / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Considerando a enorme escala do ambiente, mesmo as frequências de transformação de 10−9−10−10 não podem ser subestimadas, pois terão um impacto nas populações de bactérias.

O HPTT de alta frequência descrito neste artigo pode envolver não apenas o mecanismo de formação de poros, mas também uma parte das funções do gene de competência e possivelmente outro mecanismo desconhecido, como mencionado acima. Como os bacteriófagos são um dos organismos mais abundantes na biosfera e onipresentes no ambiente (Clokie et al., 2011), o HPTT induzido por fago também é considerado viável no ambiente, bem como a transdução comum e outros derivados de fago formas de HGT, por exemplo, agentes de transferência de genes (Lang et al., 2012).

Conclusão e perspectiva

No geral, nossos resultados e dados anteriores relacionados indicam que vários mecanismos induzem a transformação- tipo HGT em E. coli com base em várias circunstâncias ambientais e celulares, como a natureza da mídia (por exemplo, água e alimentos), temperatura variável de sub-zero a ∼40 ° C, alta densidade celular em biofilmes e origens genéticas variadas das cepas envolvidas. A contribuição do HGT do tipo de transformação para a dinâmica genética no ambiente pode estar subestimada (Bushman, 2002; Thomas e Nielsen, 2005), e nossos estudos indicam que o HPTT em E.coli ocorre em frequências de transferência substanciais (10−5−10−10) sob as condições que podem ser encontradas no ambiente. Portanto, HGT do tipo de transformação pode contribuir para a disseminação de genes de resistência a antibióticos e surgimento de bactérias multirresistentes no ambiente real fora dos laboratórios. Mais estudos são necessários para entender o papel preciso e a contribuição do HGT do tipo de transformação na disseminação da resistência aos antibióticos.

Contribuições dos autores

HH, ES e SM escreveram o artigo.

Financiamento

Este trabalho foi financiado por JSPS KAKENHI (Concessão # 25292051).

Declaração de Conflito de Interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Somos gratos à Enago (www.enago.jp) pelo Inglês serviços de edição e revisão.