Metoda experimentală

La fel ca formula utilizată pentru calcularea raportului semnal / zgomot poate avea un efect dramatic asupra sensibilitatea aparentă a oricărui set de date spectral particular, configurația hardware a instrumentului și parametrii experimentali ai achiziției de date au, de asemenea, un efect dramatic asupra calității spectrului dobândit.

Există mulți parametri hardware, setările și opțiunile care toate au un efect asupra sensibilității măsurate a unui spectrofluorometru. Acest lucru poate face extrem de dificilă compararea absolută a sensibilității relative a două instrumente diferite, dacă acestea nu sunt utilizate într-un mod practic identic. Mai jos discutăm fiecare dintre acești factori și impactul pe care îl au asupra datelor rezultate.

Aplicabil tuturor fluorometrelor de scanare

Lungime de undă de excitație: lungimea de undă de excitație ar trebui să fie identică pentru toate sistemele comparate. Metoda HORIBA folosește excitație de 350 nm pentru banda de apă Raman, la fel ca majoritatea celorlalți producători. Atunci când este excitant la 350 nm, banda de emisie Raman pentru apă are un vârf la 397 nm.

Este fericit că majoritatea producătorilor au standardizat această lungime de undă de excitație, deoarece permite o comparație mai bună. Cu toate acestea, este perfect valabil să mutați lungimea de undă de excitație la orice altă valoare ca o modalitate de a testa sensibilitatea într-un interval diferit de lungimi de undă (de exemplu, NIR).

Gama de scanare a emisiilor: metoda HORIBA scanează monocromatorul de emisie de la 365 la 450 nm, cu trepte de 0,5 nm, pentru a colecta întregul vârf Raman la 397 nm și, de asemenea, fundalul la 450 nm.

Lățime de bandă (dimensiunea fantei): metoda HORIBA folosește bandpass de 5 nm fante atât pe spectrometrul de excitație cât și pe cel de emisie. Unii producători specifică fante de 10 nm, ceea ce are ca efect creșterea sensibilității în comparație cu 5 nm. S-a raportat că dublarea dimensiunii fisurii fizice la intrarea și ieșirea unui monocromator poate cvadrupla intensitatea excitației și capacitatea de detectare a emisiilor, deoarece debitul crește pe măsură ce pătratul mărimii crește, dar aceasta este o estimare simplistă care ar trebui măsurată empiric. HORIBA a măsurat diferența de factor cu HORIBA Fluoromax și a observat că pentru Fluoromax, dublarea dimensiunii fantei de la 5 la 10 nm crește raportul general semnal / zgomot pentru banda de apă Raman cu un factor de peste 3 ori. Cu toate acestea, acest lucru va fi diferit pentru toate fluorometrele, așa că vă rugăm să vă asigurați că nu comparați cu benzile de bandă identice.

Timp de integrare (sau Timp de răspuns): Aceasta se referă la cât timp detectorului i se permite să colecteze un semnal la un anumit moment poziția pasului lungimii de undă. De asemenea, joacă un rol semnificativ în sensibilitatea generală măsurată pentru un fluorometru. Metoda HORIBA utilizează un timp de integrare de 1 secundă la fiecare punct de lungime de undă, similar cu alți producători. Cu toate acestea, unii producători specifică un timp de răspuns de 2 secunde, care crește raportul total semnal / zgomot cu aproape un factor de doi. Asigurați-vă că utilizați același timp de integrare (răspuns) la comparare.

Tipul PMT: Majoritatea spectrofluorometrelor utilizează un tub fotomultiplicator (PMT) ca singurul lor detector de emisie de fluorescență, fără nicio opțiune pentru schimbarea carcasei detectorului. Acest lucru este valabil pentru majoritatea fluorometrelor analitice de top. Unele dintre aceste sisteme de bază permit selectarea diferitelor PMT-uri individuale, cu intervale și specificații diferite de lungime de undă. PMT-urile care nu detectează atât de departe în NIR ca și alte PMT-uri vor avea un număr mai scăzut de întuneric, astfel încât să ofere un raport semnal / zgomot mai bun în intervalul de la 350 la 400 nm, totuși este posibil să nu fie utilizabile pe întreaga lungime de undă a emisiilor intervalul dorit pentru un anumit laborator. PMT standard al HORIBA utilizat în fluorometrele FluoroMax Plus, Fluorolog3 și QuantaMaster 8000, este Hamamatsu R928P PMT, care este considerat standardul industrial pentru fluorometrie. În aceste cazuri, asigurați-vă că fiecare fluorometru utilizează același PMT, acolo unde este posibil.

Filtre optice: un filtru optic poate fi adăugat la calea optică a unui fluorometru, fie pe partea de excitație, fie pe partea de emisie. a probei. Acestea pot fi așezate manual într-un suport de filtru din interiorul compartimentului pentru probe sau pot face parte dintr-o roată de filtrare care poate plasa automat diferite filtre în calea optică atunci când sunt selectate diferite protocoale experimentale. Filtrele optice au efectul de a îmbunătăți respingerea luminii rătăcite la anumite lungimi de undă și pot îmbunătăți dramatic raportul semnal / zgomot al unui fluorometru. HORIBA nu folosește filtre optice, altele decât spectrometrele de scanare, atunci când specifică SNR pentru apă Raman cu specificațiile seriei Fluoromax, Fluorolog3 sau QuantaMaster 8000.Când comparați un fluorometru HORIBA, cu un fluorometru care utilizează filtre automate, vă rugăm să nu utilizați un filtru sau, dacă este automat, confirmați ce marcă și tip de filtre sunt utilizate și unde sunt utilizate, pentru a reproduce o metodă experimentală similară cu un fluorometru HORIBA.

Aplicabil fluorometrelor de cercetare modulare

Tip de detector: fluorometrele de cercetare modulare includ de obicei o carcasă PMT ca standard, dar permit multor tipuri diferite de detectoare cu un singur canal să extindă lungimea de undă sau intervalul de viață al fluorescenței unui instrument. Detectoarele alternative includ carcase PMT răcite, diverse detectoare de stare solidă precum InGaAs, MCP PMT’s și așa mai departe. Aceste diferite tipuri de detectoare vor avea efecte dramatice asupra raportului semnal / zgomot al oricărei măsurători de probă, așa că, din nou, atunci când încercați să comparați sensibilitatea unui fluorometru cu altul, asigurați-vă că același tip de detector este utilizat pentru a colecta date pe ambele sisteme.

Temperatura detectorului: Majoritatea spectrofluorometrelor comerciale folosesc carcase PMT care nu sunt răcite și, de fapt, multe instrumente nici măcar nu oferă o opțiune de detector răcit. O carcasă PMT răcită poate îmbunătăți sensibilitatea unui instrument prin reducerea numărului de întuneric (fundal) comparativ cu același PMT exact într-o carcasă ambientală. Carcasele PMT standard HORIBA din FluoroMaxPlus, Fluorolog3 și QuantaMaster 8000 sunt carcase PMT ambientale, cu toate acestea, seriile Fluorolog3 și QuantaMaster 8000 oferă carcase opționale PMT răcite pentru a îmbunătăți sensibilitatea și detectarea NIR. Atunci când comparați fluorometre modulare de cercetare, asigurați-vă că comparați datele colectate cu același tip de carcasă PMT (ambiantă sau răcită) și, dacă sunt răcite, apoi răcite la aceeași temperatură.

Monocromator dublu versus versatil: modular fluorometrele de cercetare permit unui cercetător să selecteze monocromatori simpli sau dubli fie pe cale de excitație, fie pe cale optică de emisie. Aici termenul monocromator dublu se referă la două etape de grătar dispersive, una după alta, cu o fantă de intrare, o fantă intermediară și o fantă de ieșire. Un monocromator dublu poate fi configurat fie în modul aditiv, fie în modul dispersiv, dar în ambele cazuri caracteristicile de transfer și de lumină vagabondă ale unui monocromator singur față de un monocromator dublu sunt foarte diferite și vor avea un impact mare asupra SNR al unei scanări Raman cu apă, chiar dacă lățimile de bandă, timpii de integrare și lungimile de undă sunt menținute constante.

Densitatea canelurilor a grătarului: Densitatea canelurilor a unei grile va afecta, de asemenea, capacitatea de transfer și, prin urmare, sensibilitatea unui spectrofluorometru. Pentru majoritatea spectrofluorometrelor, aceasta nu este o problemă prea mare, deoarece sistemele sunt fabricate cu o singură rețea specială. În acest caz, cel mai important lucru este să vă asigurați că benzile sunt selectate pentru a fi aceleași. Cu toate acestea, pentru fluorometre modulare, puteți configura monocromatoarele cu diferite grătaruri sau grilaje multiple. Pentru aceste sisteme, trebuie să aveți mare grijă să păstrați lucrurile cât mai asemănătoare posibil. De exemplu, atunci când aveți două instrumente care au spectrometre de distanță focală similare, modificarea densității canelurilor a grătarului va crește sau reduce sensibilitatea pentru aceeași setare de trecere de bandă de 5 nm. Metoda HORIBA folosește grilaje cu o densitate a grovei de 1.200 caneluri pe milimetru.

Unghiul de grilare a grăsimii: grilajele selectate pentru un monocromator de excitație sau emisie asigură un randament optim la o anumită bandă de lungime de undă, denumită blaze. unghi, deoarece acesta este determinat de unghiul de gravare a grătarului dat pe suprafața grătarului. Ca atare, un monocromator de excitație cu un monocromator de excitație de 350 nm și un monocromator de emisie de 400 nm, ar fi alegeri optime pentru a obține cea mai bună sensibilitate la apă Raman atunci când este excitant la 350 nm. Deoarece majoritatea fluorometrelor nu vă permit să reglați grătarul, această variabilă nu este un factor, dar pentru cei care vă permit să alegeți grătaruri, asigurați-vă că alegeți grătare cu același unghi de ardere sau foarte similar, pentru a face o comparație validă .