Introducere

Transferul de gene orizontal (HGT) între celulele bacteriene contribuie la adaptarea bacteriilor la diferite medii și, pe termen lung, la evoluția bacteriană (Lorenz și Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas și Nielsen, 2005). Cu toate acestea, în mediile umane, provoacă răspândirea nedorită a patogenității, rezistenței la antibiotice sau a genelor modificate artificial (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly și colab., 2009a, b). Trei mecanisme ale HGT în bacterii sunt în general acceptate: conjugarea, transducția și transformarea (Bushman, 2002; von Wintersdorff și colab., 2016). Conjugarea și transducția implică aparate specifice pentru transferul ADN de la celulele donatoare la celulele receptoare; aceștia sunt virioni conjugați pili și respectiv fagi. Transformarea este în primul rând o funcție a celulelor receptor care exprimă competența de a prelua ADN-ul gol extracelular.

Competența de transformare poate fi indusă în mod natural sau artificial, dar nu toate speciile bacteriene dezvoltă competența naturală (Lorenz și Wackernagel, 1994; Johnston și colab., 2014). La bacteriile natural transformabile, competența este de obicei tranzitorie și indusă de modificări ale stării de creștere a organismului (Johnston și colab., 2014). A fost identificat un grup de „gene de competență” și au fost propuse modele mecaniciste generale (Chen și Dubnau, 2004), deși mecanismele precise pentru speciile individuale de bacterii nu au fost suficient de elucidate (Cameron și Redfield, 2006, 2008; Sinha și colab. ., 2009; Seitz și Blokesch, 2013; Johnston și colab., 2014; Jaskólska și Gerdes, 2015). Deoarece transformarea necesită ADN gol extracelular ca substrat, sensibilitatea la DNază, care degradează ADN-ul gol, este esențială pentru a distinge transformarea de altele. Mecanisme HGT rezistente la DNază (Lorenz și Wackernagel, 1994; Giovanetti și colab., 2005; Marshall și colab., 2010; Rohrer și colab., 2012; Blesa și Berenguer, 2015).

În general, Escherichia coli nu se crede că poate fi transformată în mod natural; dezvoltă o competență genetică ridicată numai în condiții artificiale, inclusiv expunerea la concentrații ridicate de Ca2 + și șoc de temperatură (Mandel și Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook și colab., 1989), polietilen glicol trata ment (Chung și colab., 1989; Sambrook și colab., 1989) sau șoc electric (Sambrook și Russell, 2006). Cu toate acestea, se pare că E. coli poate exprima o competență modestă în anumite condiții care sunt fezabile în mediile sale naturale (Baur și colab., 1996; Bauer și colab., 1999; Tsen și colab., 2002; Woegerbauer și colab., 2002) . În cele ce urmează, definim transformarea în care plasmida a fost adăugată extern ca transformare de plasmidă (PT) și transformare în care ADN-ul plasmidic provine din celule bacteriene moarte (din mediu) ca transfer orizontal de plasmidă prin transformare (HPTT).

Escherichia coli pare să posede mai multe mecanisme de absorbție a ADN-ului, inclusiv două populare: unul care este dependent de „genele competenței”, care funcționează în mod obișnuit în multe bacterii gram-negative și pozitive (Finkel și Kolter, 2001; Palchevskiy și Finkel, 2006; Sinha și colab., 2009; Sinha și Redfield, 2012; Seitz și Blokesch, 2013; Johnston și colab., 2014; Jaskólska și Gerdes, 2015). Acest mecanism este condus în principal de aparatul molecular specific format în jurul suprafeței celulare , care trec prin membranele celulare numai ADN liniar monocatenar produs folosind o nuclează periplasmatică specifică. În E. coli, aceste gene nu sunt considerate a contribui la PT, deoarece PT necesită absorbția dublei s ADN circular trandat (Sinha și Redfield, 2012; Johnston și colab., 2014). Prin urmare, este puțin probabil ca acest mecanism să contribuie la PT în mediu. Al doilea mecanism este cel dependent de factori externi de mediu, cum ar fi ionii metalici divalenți, șocul termic și solicitările fizice (Mandel și Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán și colab., 2013). Acești stimuli sunt în mod obișnuit considerați că induc formarea de structuri asemănătoare porilor pe suprafața celulei pentru trecerea ADN-ului dublu catenar intact, inclusiv plasmide circulare, deși detaliile rămân neclare (Reusch și colab., 1986; Reusch și Sadoff, 1988; Huang și Reusch, 1995; Sun și colab., 2013; Asif și colab., 2017). Ionii Ca2 + și Mg2 + sunt cei mai tipici factori care induc competența. Habitatele de mediu conțin adesea câțiva milimolari din acești ioni, ale căror concentrații sunt suficiente pentru a induce o competență slabă, dar detectabilă în E. coli (Baur și colab., 1996; Bauer și colab., 1999; Maeda și colab., 2003). Prin urmare, acest mecanism este posibil în mediul din afara laboratoarelor. În plus față de cele două mecanisme de mai sus, un alt mecanism a fost propus de Sun și colab. (2006, 2009), Zhang și colab. (2012), Guo și colab.(2015) și Sun (2016), în care sunt implicați un transportor ABC și proteine specifice membranelor periplasmatice și interne. Acest mecanism este reglementat de regulatori de transcripție interni, RpoS și CRP, prin urmare s-a sugerat că acest mecanism este, de asemenea, un proces natural controlat genetic.

În această mini revizuire, vom rezuma studiile noastre privind HGT folosind E. coli sisteme experimentale și discută posibila apariție a transformării prin mecanisme multiple în medii naturale și posibilul său impact asupra răspândirii genelor de rezistență la antibiotice.

Transformarea plasmidei E. coli în condiții care mimează mediul natural

PT în extracte alimentare

Alimentele umane sunt medii de cultură excelente pentru multe bacterii. Cu toate acestea, s-a acordat puțină atenție efectelor alimentelor asupra fiziologiei bacteriene, altele decât creșterea și supraviețuirea. Am investigat posibilitatea ca alimentele să acționeze ca medii pentru transformarea bacteriană. Alimentele conțin adesea concentrații milimolare de ioni metalici divalenți (Ca2 + și Mg2 +) și sunt adesea depozitați într-un frigider sau congelator urmat de încălzire rapidă (adică șoc termic). Aceste condiții sunt favorabile dezvoltării competenței în E. coli (Mandel și Higa, 1970; Huang și Reusch, 1995; Baur și colab., 1996); deoarece E. coli este un contaminant alimentar obișnuit, este interesant să stabilim dacă poate fi transformat în alimente. Anumite alimente pot acționa într-adevăr ca medii care induc competența în E. coli (Maeda și colab., 2003). Din 42 de probe de alimente testate, > 10 au prezentat capacitatea de a induce competența la o frecvență de 10−7−10−9. Dintre acestea, supernatantul din tofu (un aliment de tip brânză din lapte de soia coagulat) a prezentat cea mai mare activitate (una din 10−7−10−8 celule primitoare), corespunzând aproximativ jumătate din eficiența obținută cu 100 mM CaCl2. Cu toate acestea, nu au existat corelații clare între frecvențele de transformare și caracteristicile chimice ale alimentelor (concentrații de Ca2 + sau Mg2 + și pH), sugerând că factorii complexi din cadrul alimentelor afectează dezvoltarea competențelor. Efectele similare ale alimentelor în inducerea transformării au fost raportate la E. coli (Bauer și colab., 1999) și Bacillus subtilis (Brautigam și colab., 1997; Zenz și colab., 1998).

PT în Biofilm Solid-Air

Multe bacterii există ca biofilme în medii naturale și artificiale (Davey și O’Toole, 2000). Biofilmele sunt agregate de microbi care se formează la interfețele solid-lichid sau solid-aer (SA) (Anderl și colab., 2000; Carmen și colab., 2004). Celulele din aceste culturi cu densitate mare interacționează între ele și exprimă funcții fiziologice distincte în comparație cu formele lor planctonice libere. Studiile anterioare privind transformarea E. coli s-au concentrat exclusiv pe celulele planctonice (Mandel și Higa, 1970; Hanahan, 1983), dar am arătat că celulele E. coli din biofilmele SA dezvoltă competență la o frecvență de 10−6−10−8 pe diferite medii solide, inclusiv agar LB și H2O și diverse alimente umede (Maeda și colab., 2004). Celulele vii coexistă în general cu celulele moarte din biofilme, iar acestea din urmă își pot elibera ADN-ul și anumiți ioni metalici divalenți, inclusiv Ca2 + și Mn2 +, în microambientul local al biofilmului (Davey și O’Toole, 2000; Whitchurch și colab., 2002 ). Aceste condiții pot fi favorabile dezvoltării transformării și pot să nu fie exclusive pentru biofilmele SA, deoarece a fost raportată și o îmbunătățire similară a biofilmelor aer-lichide de E. coli (Król et al., 2011).

PT de tulpini de E. coli sălbatice în apă

Rezultatele noastre și ale altora sugerează că E. coli din mediu poate dobândi ADN străin prin transformare. Cu toate acestea, există puține rapoarte anterioare de investigații privind transformabilitatea tulpinilor naturale de E. coli (Woegerbauer și colab., 2002; Sinha și Redfield, 2012). Prin urmare, am examinat potențialul tulpinilor naturale de E. coli de a dezvolta competența în condiții de mediu. Am folosit o colecție standard de tulpini de referință E. Coli (ECOR) ca modelul nostru de E. coli natural (Ochman și Selander, 1984) deoarece aceste tulpini ECOR au fost utilizate pe scară largă în diferite studii privind fiziologia, comportamentul și variația genotipică a E. coli natural (Tenaillon și colab., 2010). Am constatat că unele tulpini ECOR au prezentat o transformabilitate detectabilă (10-10-10-10) în apă naturală (apă pură îmbuteliată disponibilă comercial) la temperaturi constante și variabile între 5 și 35 ° C și la temperaturi de iarnă într-un experiment de câmp, sugerând că E. coli natural poate dezvolta competențe în anumite condiții care ar putea apărea în mod fezabil în mediu (Matsumoto și colab., 2016b).

Transferul orizontal al plasmidei prin transformare în E. coli

HPTT indus de înghețare-degivrare în ape naturale și extracte alimentare

În mediu, ADN-ul gol poate fi furnizat în mod natural din celulele moarte către celulele învecinate din același habitat sau microambient.Prin urmare, merită investigată posibilitatea HPTT într-un sistem închis în anumite condiții fezabile. Înghețarea-dezghețul este un proces obișnuit în manipularea alimentelor și are loc și în natură. Tratamentul îngheț-dezgheț al celulelor E. coli poate favoriza scurgerea ADN din celulele moarte și absorbția ulterioară de către celulele supraviețuitoare, deoarece acestea răspund la șocul termic, rezultând transformarea in situ (Li și colab., 1992; Takahashi și colab., 1992). Acest tratament al suspensiilor condensate de tulpini mixte de E. coli în ape naturale și extracte alimentare a provocat transferul lateral in situ al plasmidelor neconjugative la o frecvență de 10−8−10−10 (Ishimoto și colab., 2008). Acest fenomen s-a produs și după 1-2 luni de depozitare la -20 ° C, iar sensibilitatea sa la DNază a demonstrat că a fost mediată printr-un mecanism de transformare.

Frecvența scăzută a HPTT în biofilmele SA

Se crede că biofilmele sunt medii potrivite pentru transformarea in situ, deoarece celulele vii și cele moarte coexistă în imediata apropiere, iar ADN-ul eliberat din celulele moarte se acumulează adesea în jurul celulelor vii. În plus, așa cum s-a descris mai sus, deoarece celulele E. coli pot dezvolta o competență modestă în biofilmele SA (Maeda și colab., 2004), ambii factori contribuie la HPTT în biofilme. Prin simpla co-cultivare a unei tulpini fără plasmide cu una care adăpostește o plasmidă neconjugativă într-un biofilm SA pe medii de agar fără antibiotice, celulele transformate au fost produse la frecvență scăzută (10−9−10−10) în decurs de 24-48 ore (Maeda și colab., 2006). Culturile lichide ale acelorași tulpini din bulionul LB nu au produs niciun transformant sau puțini transformanți, sugerând importanța formării biofilmului SA pentru transferul plasmidelor. În esență, același fenomen s-a produs și în biofilmele SA pe suporturi alimentare (Ando și colab., 2009). Acest fenomen a apărut și între tulpinile populare de laborator, cum ar fi DH5, HB101 și MG1655 (Etchuuya și colab., 2011), care sunt lipsite de fagi lizogeni și fără aparate conjugative, sugerând că frecvența scăzută a transferului orizontal de plasmide în biofilmele SA poate fi au loc fără ajutorul fagului sau al mașinilor de conjugare și, prin urmare, acest transfer de ADN se datorează unui fel de transformare. Cu toate acestea, deoarece mutația rpoS− nu a afectat acest HPTT (Maeda și colab., 2006), este puțin probabil ca mecanismul dependent de RpoS (Zhang și colab., 2012) să fie implicat.

Frecvența înaltă a HPTT Indus de fagul P1

Prin evaluarea combinațiilor mai multor tulpini și plasmide pentru transferul orizontal al plasmidei, sa constatat că tulpina E. coli CAG18439 acționează atât ca donator de plasmidă, cât și ca receptor de plasmidă în combinație cu plasmida pHSG299 și ar putea transfera frecvent plasmida într-o cultură de celule mixte chiar și într-un mediu lichid (Etchuuya și colab., 2011). S-a demonstrat că acest HGT este un tip de transformare, deoarece transferul de plasmidă de înaltă frecvență (10-5-10-10) a fost sensibil la DNază. Studii suplimentare au arătat că acest fenomen prezintă unele caracteristici specifice: (1) promovarea prin factor proteic eliberat din CAG18439 (Etchuuya și colab., 2011); (2) promovarea printr-o secvență de 88 bp pe pHSG299 (Sobue și colab., 2011); (3) frecvență mare de transfer (Etchuuya și colab., 2011; Sobue și colab., 2011); și (4) dependența de gene specifice (Kurono și colab., 2012; Matsuda și colab., 2012). În ceea ce privește (1), un studiu ulterior a arătat că acești factori proteici includ o particulă de fag P1vir (sau un derivat al acestuia) și că fagul P1vir adăugat extern poate reproduce transferul orizontal de plasmide între celulele E. coli și celelalte trei caracteristici majore ale CAG18439 -HPT dependent (Sugiura și colab., 2017). Acest fenomen a fost, de asemenea, sensibil sensibil la DNază, sugerând că o mare parte a acestui transfer de plasmidă se datorează transformării în ciuda implicării fagului P1. Mecanismul de transformare a transferului plasmidic indus de fagul P1vir se poate datora infecției fagului sau trezirii spontane a fagului lizogenizat în celulele care conțin plasmide, ducând la liza celulară și eliberarea ulterioară a ADN-ului plasmidic intracelular într-o formă utilizabilă pentru transformare. Deși un astfel de mecanism este în general fezabil, au existat puține demonstrații clare ale acestuia în E. coli. Un studiu recent realizat de Keen și colab. (2017) folosind alt sistem de fagi au demonstrat, de asemenea, un mecanism de transformare indus de fag similar în E. coli. Cu toate acestea, HPTT de P1vir sau CAG18439 nu poate fi explicat în mod adecvat doar prin aprovizionarea cu ADN îmbunătățită din liza celulară indusă de fag și diferă de transformarea simplă în E. coli (Hanahan, 1983) în ceea ce privește caracteristicile sale distinctive (2-4). În ceea ce privește (2), secvența 88-bp pe pHSG299 nu este omologă cu partea din secvența genomului fagului P1. Această secvență se găsește adesea în bazele de date dintre secvențele vectoriale de clonare generală, dar nu în orice sursă naturală. Urmărind procesul de construcție al pHSG299 (Hashimoto-Gotoh și colab., 1981; Brady și colab., 1984; Takeshita și colab., 1987), totuși, suspectăm că secvența 88-bp provine din R6-5, a plasmida R conjugativă.Această secvență și elemente de ADN similare pot contribui la HPTT de R și alte plasmide din mediu. În ceea ce privește (3), acest transfer de înaltă frecvență nu poate fi explicat prin simpla capacitate PT a CAG18439 și a altor tulpini utilizate deoarece PT simplă în acele tulpini în condiții de cultură echivalentă a fost de 105-102 de ori mai puțin frecventă (Etchuuya și colab., 2011). Prin urmare, sa sugerat că un factor proteic derivat din CAG18439, cu dimensiunea estimată între 9 și 30 kDa (Etchuuya și colab., 2011), ar putea fi, de asemenea, implicat în promovarea HPTT. Acest factor ajută probabil la absorbția ADN-ului de către celulele primitoare, probabil în combinație cu secvența 88-bp de pe ADN-ul în transformare. În cele din urmă, în ceea ce privește (4), studii ulterioare de screening la nivelul genomului pentru genele destinatarilor implicate în HPTT au sugerat că mai multe gene participă la mecanism (Kurono și colab., 2012; Matsuda și colab., 2012; Shibata și colab., 2014a ). Acestea includ cele care nu au fost raportate ca fiind implicate în transformarea naturală sau artificială în E. coli (cum ar fi rodZ) și câțiva omologi genici de competență cunoscuți, cum ar fi ybaV și yhiR (Finkel și Kolter, 2001; Palchevskiy și Finkel, 2006 ), dar nu includ rpoS și alte gene legate de mecanismul dependent de RpoS (Zhang și colab., 2012). În ansamblu, aceste rezultate indică un mecanism necunoscut și complex al HPTT indus de fag, de înaltă frecvență, care poate împărți parțial calea transformării naturale.

HPTT între tulpinile naturale de E. coli

Pentru a evalua în continuare generalitatea și varietatea HPTT la tulpinile de E. coli, tulpinile naturale (tulpinile ECOR menționate mai sus) au fost utilizate într-un studiu al HPTT. Mai multe combinații de tulpini ECOR au fost co-cultivate în mediu lichid, rezultând un transfer orizontal sensibil la DNază a genelor naturale de rezistență la antibiotice (Matsumoto și colab., 2016a, b). Izolarea plasmidei din acești noi transformanți a demonstrat transferul orizontal de plasmide între tulpinile ECOR (Matsumoto și colab., 2016a, b). Experimentele PT simple folosind aceleași tulpini ECOR au arătat că HPTT apare mult mai frecvent (10−6−10−8) decât PT simplu (sub 10-10) în aceleași condiții de cultură, ceea ce a sugerat că HPTT este unic și eficient. Mai mult decât atât, am descoperit că 6 din cele 12 combinații ale tulpinilor ECOR, dintre care unele nu produc fagi care formează plăci (Shibata și colab., 2014b), au prezentat transfer de gene sensibile la DNază, ceea ce ne-a făcut să bănuim că HPTT este destul de frecvent în natură. Tulpini de E. coli. În general, aceste date sugerează că unele mecanisme de transformare fără fag și conjugare există în mod natural și în unele tulpini de E. coli și că HPTT al plasmidelor naturale rezistente la antibiotice (cum ar fi plasmidele tulpinii ECOR24: Nr. De acces AB905284 și AB905285) poate fi o cale pentru producerea celulelor naturale E. coli rezistente la medicamente.

Posibile mecanisme și fezabilitatea PT și HPTT în E. coli în mediu

Exemple de PT și HPTT indus de îngheț-dezgheț și de joasă frecvență introdus în această mini-revizuire sunt probabil mai mult legate de mecanismul de formare a porilor decât mecanismul de competență dependent de gena, deoarece alimentele și apele naturale conțin adesea niveluri mM de ioni Ca2 + și Mg2 + (Baur et. al., 1996, Bauer și colab., 1999; Maeda și colab., 2003) și mediul biofilmului furnizează celulelor vii conținutul de celule moarte, inclusiv ioni metalici divalenți și ADN plasmidic transformabil. După cum am descris anterior (Maeda și colab., 2006), un biofilm SA (diametru, 10-12 mm; grosime, 0,5-0,8 mm) conține aproximativ 2-5 × 109 celule. În plus, bacteriile intestinale la mamifere se ridică în general la aproximativ 1011 celule / g (Zoetendal și colab., 2004; Sekirov și colab., 2010). Având în vedere scara enormă a mediului, chiar și frecvențele de transformare de 10−9−10−10 nu pot fi subestimate, deoarece acestea vor avea un impact asupra populațiilor de bacterii.

HPTT de înaltă frecvență descris în acest articol poate implica nu numai mecanismul de formare a porilor, ci și o parte a funcției genei de competență și, eventual, un alt mecanism necunoscut, așa cum am menționat mai sus. Deoarece bacteriofagii sunt unul dintre cele mai abundente organisme din biosferă și omniprezente în mediu (Clokie și colab., 2011), HPTT indus de fagi este, de asemenea, considerat fezabil în mediu, precum și transducția obișnuită și alte produse derivate din fagi. moduri de HGT, de exemplu, agenți de transfer genic (Lang și colab., 2012).

Concluzie și perspectivă

În general, rezultatele noastre și datele anterioare asociate indică faptul că mai multe mecanisme induc transformarea- tip HGT în E. coli pe baza diferitelor circumstanțe de mediu și celulare, cum ar fi natura mediului (de exemplu, apă și alimente), temperatura variabilă de la sub zero la ~ 40 ° C, densitatea celulară ridicată în biofilme și diferite medii genetice a tulpinilor implicate. Contribuția HGT de tip transformare la dinamica genetică din mediu poate fi subestimată (Bushman, 2002; Thomas și Nielsen, 2005), iar studiile noastre indică faptul că HPTT în E.coli apare la frecvențe de transfer substanțiale (10−5−10−10) în condițiile care pot fi întâlnite în mod fezabil în mediu. Prin urmare, HGT de tip transformare poate contribui la răspândirea genelor de rezistență la antibiotice și la apariția bacteriilor multirezistente în mediul real din afara laboratoarelor. Sunt necesare studii suplimentare pentru a înțelege rolul precis și contribuția HGT de tip transformare în răspândirea rezistenței la antibiotice.

Contribuțiile autorului

HH, ES și SM au scris lucrarea.

Finanțare

Această lucrare a fost susținută de JSPS KAKENHI (Grant # 25292051).

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost desfășurată în absența oricărei relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretată ca un potențial conflict de interese.

Mulțumiri

Suntem recunoscători Enago (www.enago.jp) pentru limba engleză servicii de editare și corectură.