Introducere

Staphylococcus aureus este un important agent patogen uman izolat de la pacienții spitalizați din întreaga lume, care provoacă atât infecții spitalicești, cât și comunitare ( Lowy, 1998). Acest agent patogen este agentul etiologic al mai multor infecții sistemice diferite, care afectează pielea și țesutul moale, precum și sistemele musculo-scheletice și circulatorii (Lowy, 1998; Changchien și colab., 2016). S-a raportat că S. aureus poate supraviețui în macrofagele derivate din monocite umane (Kubica și colab., 2008). Virulența S. aureus este strâns asociată cu o varietate de enzime și toxine secretate produse de bacterii (Otto, 2014). Hemolizina, leucocidina (leucocidina Panton – Valentine, PVL) și sindromul de șoc toxic toxina-1 (TSST-1), facilitând deteriorarea membranei eritrocitare, lezând funcția fagocitară a leucocitelor și inducând sindromul șocului toxic, sunt critice procesele patogene ale S. aureus (Löffler și colab., 2010; Vandenesch și colab., 2012; Berube și Bubeck Wardenburg, 2013; Andrey și colab., 2015; Al Laham și colab., 2015). Studii recente au demonstrat că hemolizina participă, de asemenea, la formarea biofilmului S. aureus (den Reijer și colab., 2016). Prevalența crescândă a tulpinilor de S. aureus rezistente la medicamente în mediile spitalicești și comunitare crește în continuare pericolele S. aureus și reprezintă o provocare serioasă pentru terapia clinică (Voss și Doebbeling, 1995; Evangelista Sde și de Oliveira, 2015) p>

Recent, un număr de tulpini aparținând unei clase de S. aureus cu un fenotip hemolitic incomplet (SIHP) au fost găsite în spitalul nostru. Hemoliza cauzată de aceste tulpini SIHP este semnificativ diferită de inelul hemolitic complet (fenotip β-hemolitic) produs în alte tulpini de S. aureus. Cu toate acestea, aceste tulpini SIHP nu au fost încă identificate și caracterizate în mod cuprinzător. Pentru a explora caracteristicile microbiologice ale acestor tulpini SIHP, am colectat 60 de tulpini SIHP și le-am studiat folosind criterii multiple, inclusiv fenotip hemolitic, expresia genei hemolizinei, caracteristici de rezistență la medicamente și virulență. Acest studiu demonstrează că SIHP-urile sunt tulpini rezistente la meticilină care exprimă foarte mult β-hemolizina și posedă un potențial ridicat de virulență.

Materiale și metode

Tulpini bacteriene

Șaizeci de SIHP tulpinile au fost izolate de la pacienții internați în cel de-al doilea spital afiliat al Universității Soochow între 2013 și 2015. Au fost prelevate probe duplicate de la fiecare pacient pentru analiză. Aceste izolate au fost apoi cultivate pe plăci de agar din sânge de oaie Columbia (CHROMagar Company, Shanghai, China) la 35 ° C într-o atmosferă conținând 5% CO2 (v / v). Identitatea tulpinilor ca S. aureus a fost confirmată utilizând sistemul de microbiologie automatizat Phoenix-100 (Becton, Dickinson and Company, SUA). Tulpinile de control S. aureus, cu fenotip hemolitic complet, au fost izolate de la pacienții din spitalul nostru în aceeași perioadă de timp. Aici, S. aureus cu fenotipul hemolitic complet a fost numit tulpini SCHP. Tulpina de referință S. aureus ATCC25923 (Shanghai Center for Clinical Laboratory, China) are fenotipul complet hemolitic și a acționat și ca tulpină martor. Comitetul de etică medicală al celui de-al doilea spital afiliat al Universității Soochow a aprobat acest studiu și toate izolatele au fost colectate cu acordul pacientului în acest studiu.

Analize comparative ale fenotipului hemolitic incomplet

S. aureus tulpini au fost cultivate pe plăci comerciale de agar din sânge de la diferite companii (CHROMagar, Autobio Diagnostics Co., Ltd., China și BioMérieux, China), precum și pe plăci de agar din sânge de oaie auto-pregătite folosind pulbere de agar din sânge Columbia (OXIDE, Marea Britanie). Bacteriile au fost cultivate la 35 ° C într-o atmosferă conținând 5% CO2 (v / v) timp de 24 de ore și apoi au fost supuse unui pasaj în serie. S-a observat apoi fenomenul hemolitic. Tulpini izolate clinic cu fenotip hemolitic complet și tulpina de referință ATCC25923 au fost, de asemenea, observate ca un control pentru analize comparative.

Determinarea nivelurilor de ARNm a celor patru gene de hemolizină ale S. aureus utilizând transcripția inversă în timp real PCR (qPCR)

Extracția totală de ARN din tulpina de referință SIHP și ATCC25923 a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Qin și colab., 2014). Inițial celulele au fost lizate folosind lizostafină, lizozimă și proteinază K. ARN-ul a fost apoi extras și purificat folosind RNeasy Mini Kit (Qiagen) conform protocolului recomandat de producător. Calitatea și concentrația ARN-ului au fost evaluate folosind NanoDrop1000. -transcris ADNc folosind un kit de transcriere inversă (Thermo Fisher Scientific Inc., SUA) conform instrucțiunilor producătorului.Pe scurt qPCR a fost efectuat după cum urmează: pre-denaturare la 94 ° C timp de 3 minute, denaturare la 94 ° C timp de 30 s, recușire la 52 ° C timp de 30 s, alungire la 72 ° C timp de 40 s, un total de 45 de cicluri . Fiecare probă a avut trei repetiții tehnice și trei repetări biologice. Profilul transcripțional al fiecăreia dintre cele patru gene ale hemolizinei și al genei ARNr 16s a fost determinat folosind metoda 2-ΔΔCt. Nivelul transcripției a fost determinat în raport cu expresia genei ARNr 16s. Secvențele a patru gene de hemolizină (hla, hlb, hlgC și hld) au fost preluate din baza de date GenBank. Software-ul Primer 5.0 a fost utilizat pentru proiectarea primerilor (Tabelul 1) și acești primeri au fost sintetizați de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China).

SPSS 17.0 a fost utilizat pentru analiza datelor. Datele de măsurare sunt prezentate ca x̄ ± s. Testul T pentru două probe independente a fost utilizat pentru a compara expresia relativă a fiecăreia dintre cele patru gene de hemolizină. Semnificația statistică a fost definită ca p < 0.05.

Detectarea expresiei α-hemolizinei (Hla) prin Western Blot

Concentrația SIHP și tulpina de referință S. aureus ATCC25923 au fost ajustate la 5,0 McFarland folosind un turometru. Proteina totală a fost apoi extrasă din fiecare probă, ajustată la aceeași concentrație și a fost supusă electroforezei pe un gel SDS-PAGE. Proteinele au fost apoi transferate într-o membrană de nitroceluloză și membrana a fost blocată cu 5% lapte degresat timp de 1 oră. Au fost adăugați anticorpi policlonali α-hemolizin anti-stafilococici de capră (Abcam) la o concentrație finală de 2 μg / ml. Amestecul de reacție a fost apoi incubat la 4 ° C peste noapte. După ce membrana a fost spălată, s-au adăugat anticorpi IgG iepure anti-capră marcate cu HRP diluate 1: 1000 și incubate la 37 ° C timp de 2 ore. În cele din urmă, s-au adăugat substraturi chemiluminescente pentru dezvoltarea culorii. Expresia α-hemolizinei a fost în cele din urmă observată sub imager.

Testarea sensibilității antimicrobiene a SIHP

Metoda de diluare a bulionului de microtitrare a fost utilizată pentru a efectua screening-ul susceptibilității antimicrobiene. Procedura a fost realizată conform manualului operațional al sistemului de microbiologie automatizat Phoenix-100. Rezultatele acestui screening au fost interpretate folosind criteriile M100-S24 introduse de Institutul de standarde clinice și de laborator (CLSI; Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014). Starea S. aureus rezistentă la meticilină (MRSA) a fost determinată utilizând MIC (concentrația minimă inhibitoare) a două antibiotice. Pentru tulpinile SIHP ≥4 μg / mL a fost MIC pentru oxalicină și ≥8 μg / mL a fost MIC pentru cefoxitină.

Detectarea genelor mecA și tst

Toate cele 60 SIHP tulpinile au fost testate pentru gena de rezistență la medicamente mecA și gena de virulență tst. Extracția la fierbere a ADN-ului genomic a fost efectuată după liză celulară folosind lizostafină. Genele mecA și tst au fost apoi amplificate din ADN-ul genomic folosind kitul DreamGreen Taq. Condițiile PCR au fost următoarele: pre-denaturare la 94 ° C timp de 3 minute, denaturare la 94 ° C timp de 30 s, recoacere la 50 ° C timp de 30 s, extindere la 72 ° C timp de 1 min. Produsele PCR au fost secvențiate și analizate de BLAST pentru a fi validate pentru a fi produsele așteptate. Secvențele genei de rezistență la medicamente mecA și ale genei de virulență ale S. aureus au fost preluate din baza de date GenBank. Software-ul Primer 5.0 a fost utilizat pentru proiectarea primerilor (Tabelul 1), iar acești primeri au fost sintetizați de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China).

Detectarea supraviețuirii tulpinilor SIHP de S. aureus în Macrofage

Pentru a compara supraviețuirea tulpinilor S. aureus SIHP din macrofage cu cea a tulpinilor SCHP S. aureus negative, linia celulară monocitară umană THP-1 a fost menținută în RPMI-1640 conținând 10% (v / v) FBS la 37 ° C într-o atmosferă conținând 5% (v / v) CO2. Pentru infecția macrofagelor, celulele THP-1 au fost însămânțate la 5 × 105 celule per godeu în vase de cultură tisulară cu 24 de godeuri și induse să se diferențieze cu 10-7 M forbol 12-miristat 13-acetat (PMA) timp de 48 de ore. Aproximativ 3 × 108 unități formatoare de colonii (CFU) de bacterii de fază logaritmică (OD600 0,5-0,6) au fost peletizate prin centrifugare, spălate de două ori cu PBS și resuspendate în 1 ml de RPMI-1640. Apoi s-au adăugat bacterii la monostratul celular la un MOI de 20: 1 și s-au centrifugat timp de 5 minute la 1000 rpm. Celulele infectate au fost incubate timp de 20 min la 37 ° C, apoi au fost spălate de trei ori cu PBS preîncălzit (pH 7,4) și incubate timp de încă 1 oră în mediu conținând 100 μg / ml gentamicină pentru a ucide bacteriile extracelulare. Celulele au fost spălate și lizate pentru a cuantifica bacteria intracelulară ca eșantion de timp zero (T0). Celule suplimentare au fost colectate după 12 sau 24 de ore de incubare în prezența unui mediu de cultură tisulară suplimentat proaspăt conținând 12 μg / ml gentamicină.Creșterea bacteriilor în celulele THP-1 a fost determinată prin împărțirea numărului de bacterii intracelulare la 12 h sau 24 h la numărul la momentul 0 (T12 / T0 sau T24 / T0). Experimentul a fost repetat independent de trei ori.

Detectarea secreției de citokine a macrofagelor infectate cu tulpini de S. aureus SIHP

Supernatanții de cultură ai macrofagelor THP-1 infectați timp de 12 ore de bacterii au fost colectate. Nivelurile de citokine au fost măsurate prin citometrie în flux FACSCalibur (BD) utilizând un kit II CBA Human Thl / Th2 Citokine II (BD) conform instrucțiunilor fabricării.

Tipul și analiza secvenței multilocus

Rezultate

Fenotipul hemolitic al tulpinilor SIHP pe plăcile de sânge de agar de oaie

După cum se arată în figurile 1A, B, inelul hemolitic complet (fenotipul β-hemolitic) a fost observat la controlul S tulpini aureus după cultivarea tulpinilor pe plăci de agar din sânge timp de 24 de ore. Cu toate acestea, fenotipuri hemolitice diferite (denumite aici fenotip hemolitic incomplet) au fost afișate în tulpinile SIHP. condiții, inclusiv condiții microaerofile, aerobe și anaerobe (Figurile 1C-E). În plus, după 10 pasaje seriale, acest fenotip hemolitic incomplet a fost încă menținut (Figura 1F).

Relativ Nivelurile de expresie a ARNm ale celor patru gene de hemolizină

Așa cum se arată în Figura 2, nivelurile de expresie ale celor patru gene de hemolizină hla, hlb, hlgC și hld din tulpinile SCHP nu au prezentat diferențe semnificative statistic (p > 0.05) comparativ cu cel al tulpinilor de control ATCC25923. Cu toate acestea, nivelurile de expresie ale hla, hlgC și hld în tulpinile SIHP au fost suprimate semnificativ de 50, 16,7 și respectiv 8,3 ori (p < 0,05) comparativ cu cel al tulpinile de control ATCC25923 și tulpinile SCHP, în timp ce expresia hlb în tulpinile SIHP a crescut semnificativ de 7,7 ori în comparație cu martorii (p < 0.05).

Detectarea α-hemolizinei prin Western Blot

A-hemolizina codificată de gena hla este o toxină formatoare de pori secretată de S. aureus și greutatea sa moleculară este de 33 kDa (Andrey și colab., 2015; Al Laham și colab., 2015). Analiza Western blot a arătat că expresia α-hemolizinei în tulpinile SIHP a fost de 40 de ori mai mică decât cea a tulpinilor SCHP și martor, ceea ce este în concordanță cu datele qRT-PCR (Figura 3).

Rezistența la medicamente a SIHP

Testată susceptibilitatea la medicamente folosind diluții de bulion de microtitrare a demonstrat că valorile MIC pentru oxacilină și cefoxitină au fost toate > 2 și > 8 μg / mL respectiv în 60 de pete SIHP . Conform ghidurilor CLSI M100-S24, toate cele 60 de tulpini SIHP sunt clasificate ca tulpini MRSA. PCR a detectat, de asemenea, gena mecA în toate cele 60 de tulpini.

Testarea genei tst

Gena tst este un factor important de virulență în S. aureus. PCR a arătat că toate cele 50 de tulpini SIHP au purtat gene tst.

Abilitatea de supraviețuire a tulpinilor de S. aureus SIHP în macrofage este mai mare decât cea a tst S. aureus negativ

Am comparat abilitățile de supraviețuire intracelulară ale tulpinilor SIHP și tst tulpina SCHP negativă în macrofage. Prin numărarea numărului de bacterii recuperate de pe plăci, am constatat că capacitatea de supraviețuire intracelulară a tulpinii SIHP a fost mult mai mare decât cea a tulpinii de S. aureus tst negative după macrofagele infectate derivate de THP-1 12 sau 24 h (Figura 4). În prealabil, am speculat că tulpinile SIHP posedă o potențială virulență ridicată și s-a sugerat că SIHP ar trebui să fie acordată mai multă atenție în spital.

Diferențele de secreție de citokine și chemokine ale macrofagelor infectate de S. aureus Tulpini SIHP și tst S. aureus negativ

Pentru a compara diferențele de secreție de citokine și chemokine în macrofagele derivate din THP-1 infectate cu tulpina SIHP și tst S. negativtulpina aureus, am detectat citokine pro-inflamatorii prin citometrie de flux în cultura supernatantă a macrofagelor infectate cu tulpini SIHP și tst tulpină S. aureus negativă. Rezultatele au arătat o inducție semnificativ mai mare a IL-2, IL-6 și IL-17A la tulpinile SIHP, dar nu de S. aureus negativ, sugerând că tulpinile SIHP induc răspunsuri citokine / chemokine în macrofage (Figura 5). Celelalte citokine IL-4, IL-10, INF-γ și TNF secretate de macrofage nu au prezentat diferențe evidente între tulpinile SIHP și grupurile afectate de S. aureus negativ.

Tipul secvenței multilocus

Am determinat genotipul multilocus al 60 de izolate SIHP colectate de la pacienții internați în spitalul nostru între 2013 și 2014. S-a aplicat schema de șapte locus recomandată în baza de date MLST S. aureus. Analiza MLST a arătat că toate tulpinile SIHP au fost clasificate în clona ST5.

Discuție

Hemolizina este unul dintre cei mai importanți factori de virulență pentru S. aureus (Wiseman, 1975). Efectele combinate ale fiecăruia dintre cele patru tipuri de hemolizină duc la distrugerea membranei eritrocitare care duce la formarea inelului hemolitic complet transparent pe plăcile de agar din sânge. În ultimii ani, SIHP au fost găsite în probele clinice ale celui de-al doilea spital afiliat al Universității Soochow. În acest studiu, am căutat să identificăm aceste tulpini și să le studiem caracteristicile în microbiologie. Inițial, am folosit diferite plăci de agar din sânge de oaie comerciale sau auto-preparate pentru a izola, incuba și trece serial tulpinile. Am arătat că există unele tulpini care prezintă și mențin un fenotip hemolitic incomplet chiar și după subcultură prelungită. Astfel, posibilitatea ca acest fenotip să fie indus de factori non-bacterieni poate fi exclusă. Studiile noastre sugerează că SIHP ar putea fi un subgrup de tulpini unice de S. aureus.

Studiile anterioare au sugerat că globulele roșii din iepure sunt extrem de sensibile la α-hemolizină (Hildebrand și colab., 1991). Berube și colab. a raportat că efectul α-hemolizinei asupra lizei eritrocitelor este dependent de concentrație (Berube și Bubeck Wardenburg, 2013). γ-hemolizina poate afecta celulele roșii din sânge ale oamenilor și animalelor (Kaneko și Kamio, 2004). În timp ce δ-hemolizina dăunează celulelor roșii din sânge, doar la concentrații mari, formează un por trans-membranar care lizează membrana celulară (Verdon și colab., 2009). În acest studiu, am arătat că expresia a patru hemolizine de tulpini SIHP și tulpini SCHP are profiluri de expresie transcripțional semnificativ diferite. Expresia α-, γ-, δ-hemolizinei în tulpinile SIHP, care ar putea deteriora direct celulele roșii, este mult mai mică decât cea a tulpinilor SCHP, în timp ce β-hemolizina are niveluri de expresie mult mai mari comparativ cu tulpinile SCHP. În plus, nivelul de exprimare a proteinelor a-hemolizinei a fost validat în continuare prin western blot. S-a raportat că β-hemolizina crește în mod predominant sensibilitatea celulelor roșii din sânge la alte toxine în loc să lizeze celulele direct, cu excepția cazului în care celulele sunt cultivate la temperaturi mai scăzute (Vandenesch și colab., 2012). În acest studiu, expresia ridicată a β-hemolizinei a fost detectată la tulpinile SIHP, dar inelul hemolitic complet nu a fost niciodată observat la tulpinile SIHP chiar și atunci când a fost incubat la 4 ° C. Aceste rezultate sugerează că fenotipul incomplet observat al tulpinilor SIHP este cel mai probabil efectele tuturor celor patru hemolizine care sunt exprimate într-un mod diferit în comparație cu tulpinile SCHP. Studiile anterioare au arătat că, în timpul patogenezei cronice, efectul combinat al presiunilor selective rezultate din antibiotice, inclusiv ciprofloxacină și trimetoprim, precum și răspunsul imun al gazdei pot duce la expresia crescută a α-hemolizinei, care este foarte importantă pentru colonizarea S .aureus în mucoasă în special în infecțiile tractului respirator (Goerke și colab., 2006; Huseby și colab., 2010). În acest studiu, toți pacienții infectați cu SIHP au primit tratament pe termen lung cu antibiotice cu spectru larg, indiferent dacă această presiune selectivă a indus supraexprimarea genelor rezistente la medicamente și a interferat cu expresia genelor hemolizinei rămâne o posibilitate care necesită mai mult examen.

Pentru a explora caracteristicile microbiologice ale SIHP, am efectuat teste de sensibilitate antimicrobiană și am ales gena de virulență tst care sunt asociate cu patogenitatea S. aureus. Am constatat că toate cele 60 de tulpini SIHP ar putea fi clasificate ca tulpini MRSA și au purtat gena mecA. Rezultatele testelor de sensibilitate antimicrobiană au arătat că, chiar și după 10 pasaje, din aceste 60 de tulpini SIHP, valorile MIC ale linezolidului și teicoplaninei doar a trei tulpini SIHP s-au schimbat puțin.Cu toate acestea, aceste modificări ale valorilor MIC nu au influențat evaluarea rezultatelor susceptibilității antimicrobiene. Gena de virulență tst codifică toxina sindromului șocului toxic (TSST-1) (Kreiswirth, 1989). Ca super antigen, TSST-1 îmbunătățește răspunsurile la șoc și supresie imună induse de endotoxine (Kulhankova și colab., 2014). Testarea PCR a constatat că toate cele 60 de tulpini SIHP posedau gena tst sugerând o virulență crescută. Recent, multe rapoarte au arătat că S. aureus ar putea supraviețui în macrofagele derivate din monocite umane și aceste tulpini de S. aureus sunt mai virulente (Kubica și colab., 2008; Tranchemontagne și colab., 2015; Münzenmayer și colab., 2016; Nandi și Bishayi, 2016). Prin urmare, am comparat abilitățile de supraviețuire intracelulară ale tulpinilor SIHP și ale tulpinilor SCHP, care este tst S. aureus negativ în macrofage și am constatat că capacitatea de supraviețuire intracelulară a tulpinii SIHP a fost mult mai mare decât cea a tulpinii tst S. aureus negative. În plus, analiza datelor despre pacienți a arătat că efectul terapiei antiinfecțioase la majoritatea pacienților infectați cu tulpini SIHP a fost mai slab decât cel al pacienților similari infectați cu tulpini SCHP (datele nu sunt prezentate). Studiul nostru oferă dovezi experimentale preliminare pentru speculațiile că tulpinile SIHP posedă o virulență potențială ridicată. de neutrofile și macrofage și producția de citokine pro-inflamatorii, în special TNF-α, IL-1β și IL-6 (Bekeredjian-Ding și colab., 2015; Giai și colab., 2016; Zhao și colab., 2016 ). S-a raportat că secreția citokinelor inflamatorii IL-6 a crescut odată cu creșterea concentrațiilor de S. aureus (Chen și colab., 2016). În plus, S. aureus superantigenic este deosebit de eficient în stimularea producției de IL-17 (Islander și colab., 2010). În acest studiu, tulpinile SIHP au arătat o inducție semnificativ mai mare a IL-2, IL-6 și IL-17A a macrofagelor comparativ cu tulpinile SCHP negative, ceea ce sugerează că tulpinile SIHP ar putea induce mai multă secreție de citokine împotriva efectului uciderii macrofagelor. În plus, analiza MLST a arătat că toate tulpinile SIHP au fost clasificate în clona ST5. Mai mult, aceste tulpini SIHP au fost grupate împreună în tipul spa al t2460 (date neprezentate).

Luate împreună, SIHP poate fi un nou subset al MRSA cu potențială virulență ridicată și ar trebui acordată mai multă atenție controlul și tratamentul acestor tulpini în spitale.

Contribuțiile autorului

Declarația privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricărui scop comercial sau relații financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Mulțumiri

Acest studiu a fost susținut de Fundația Națională de Științe Naturale din China (81572032, 81401636), Științele Naturii Fundația pentru colegii și universități din provincia Jiangsu (16KJB320006) și Programul de știință și tehnologie din Suzhou (SYSD2014094, SYS201551, SS201638).