Inledning

Horisontell genöverföring (HGT) mellan bakterieceller bidrar till bakteriell anpassning till olika miljöer och på lång sikt till bakteriell utveckling (Lorenz och Wackernagel, 1994; Bushman, 2002; Thomas och Nielsen, 2005). I mänskliga miljöer orsakar det dock oönskad spridning av patogenicitet, antibiotikaresistens eller konstgjorda gener (Bushman, 2002; Keese, 2008; Kelly et al., 2009a, b). Tre mekanismer för HGT i bakterier accepteras allmänt: konjugation, transduktion och transformation (Bushman, 2002; von Wintersdorff et al., 2016). Konjugering och transduktion involverar specifik apparat för DNA-överföring från givare till mottagande celler; dessa är konjugativa pili respektive fagvirioner. Transformation är främst en funktion av mottagarceller som uttrycker kompetens att ta upp extracellulärt naken DNA.

Transformationskompetens kan induceras naturligt eller artificiellt, men inte alla bakteriearter utvecklar naturlig kompetens (Lorenz och Wackernagel, 1994; Johnston et al., 2014). I naturligt transformerbara bakterier är kompetens vanligtvis övergående och induceras av förändringar i organismens tillväxttillstånd (Johnston et al., 2014). En grupp av ”kompetensgener” har identifierats och allmänna mekanistiska modeller har föreslagits (Chen och Dubnau, 2004), även om exakta mekanismer för enskilda bakteriearter inte har belysts tillräckligt (Cameron och Redfield, 2006, 2008; Sinha et al. ., 2009; Seitz och Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska och Gerdes, 2015). Eftersom transformation kräver extracellulär naken DNA som substrat, är känsligheten för DNase, som bryter ner naken DNA, nyckeln till att skilja transformation från andra DNasresistenta HGT-mekanismer (Lorenz och Wackernagel, 1994; Giovanetti et al., 2005; Marshall et al., 2010; Rohrer et al., 2012; Blesa and Berenguer, 2015).

I allmänhet Escherichia coli tros inte vara naturligt transformerbar; den utvecklar hög genetisk kompetens endast under artificiella förhållanden, inklusive exponering för höga Ca2 + -koncentrationer och temperaturchock (Mandel och Higa, 1970; Hanahan, 1983; Sambrook et al., 1989), polyetylenglykol behandla ment (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989), eller elektrisk stöt (Sambrook och Russell, 2006). Emellertid kan enligt uppgift E. coli uttrycka blygsam kompetens under vissa förhållanden som är möjliga i dess naturliga miljöer (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Tsen et al., 2002; Woegerbauer et al., 2002) . I det följande definierar vi transformation där plasmid tillsattes externt som plasmidtransformation (PT) och transformation där plasmid-DNA kommer från döda bakterieceller (från omgivningen) som horisontell plasmidöverföring genom transformation (HPTT).

Escherichia coli verkar ha flera DNA-upptagningsmekanismer, inklusive två populära: en som är beroende av ”kompetensgener”, som vanligtvis fungerar i många gramnegativa och positiva bakterier (Finkel och Kolter, 2001; Palchevskiy och Finkel, 2006; Sinha et al., 2009; Sinha and Redfield, 2012; Seitz and Blokesch, 2013; Johnston et al., 2014; Jaskólska and Gerdes, 2015). Denna mekanism utförs huvudsakligen av den specifika molekylära apparaten som bildas runt cellytan struktur, som passerar genom cellmembranen endast linjärt enkelsträngat DNA producerat med användning av en specifik periplasmatisk nukleas. I E. coli anses dessa gener inte bidra till PT eftersom PT kräver upptag av intakt dubbel-s tranded cirkulärt DNA (Sinha och Redfield, 2012; Johnston et al., 2014). Därför är det osannolikt att denna mekanism bidrar till PT i miljön. Den andra mekanismen är den som är beroende av externa miljöfaktorer, såsom tvåvärda metalljoner, värmechock och fysiska påfrestningar (Mandel och Higa, 1970; Hanahan, 1983; Yoshida, 2007; Rodríguez-Beltrán et al., 2013). Dessa stimuli anses vanligen inducera bildandet av porliknande strukturer i cellytan för passering av intakt dubbelsträngat DNA, inklusive cirkulära plasmider, även om detaljerna förblir oklara (Reusch et al., 1986; Reusch och Sadoff, 1988; Huang och Reusch, 1995; Sun et al., 2013; Asif et al., 2017). Ca2 + och Mg2 + -joner är de mest typiska kompetensframkallande faktorerna. Miljöhabitat innehåller ofta flera millimolära av dessa joner, vars koncentrationer är tillräckliga för att inducera svag men detekterbar kompetens hos E. coli (Baur et al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003). Därför är denna mekanism möjlig i miljön utanför laboratorier. Förutom ovanstående två mekanismer har en annan mekanism föreslagits av Sun et al. (2006, 2009), Zhang et al. (2012), Guo et al.(2015) och Sun (2016), där en ABC-transportör och specifika periplasmiska och inre membranproteiner är involverade. Denna mekanism regleras av interna transkriptionsregulatorer, RpoS och CRP, därför föreslogs att denna mekanism också är en genetiskt kontrollerad naturlig process.

I denna miniöversikt sammanfattar vi våra studier om HGT med E. coli experimentella system och diskutera möjlig förekomst av transformation genom flera mekanismer i naturliga miljöer och dess möjliga inverkan på spridningen av antibiotikaresistensgener.

Plasmidtransformation av E. coli i förhållanden som imiterar naturlig miljö

PT i extrakt av livsmedel

Mänskliga livsmedel är utmärkta odlingsmedier för många bakterier. Emellertid har föga uppmärksamhet ägnats åt effekterna av livsmedel på bakteriell fysiologi annat än tillväxt och överlevnad. Vi undersökte möjligheten att livsmedel fungerar som media för bakterietransformation. Livsmedel innehåller ofta millimolära koncentrationer av tvåvärda metalljoner (Ca2 + och Mg2 +) och förvaras ofta i kylskåp eller frys följt av snabb uppvärmning (dvs värmechockad). Dessa förhållanden bidrar till utvecklingen av kompetens i E. coli (Mandel och Higa, 1970; Huang och Reusch, 1995; Baur et al., 1996); Eftersom E. coli är en vanlig livsmedelsförorening är det intressant att avgöra om det kan transformeras i livsmedel. Vissa livsmedel kan verkligen fungera som media som inducerar kompetens i E. coli (Maeda et al., 2003). Av 42 testade livsmedelsprover uppvisade > 10 en förmåga att inducera kompetens med frekvensen 10−7−10−9. Bland dessa uppvisade supernatanten från tofu (en ostliknande mat gjord av ojämn sojamjölk) den högsta aktiviteten (en i 10−7−10-8 mottagarceller), vilket motsvarar ungefär hälften av effektiviteten som erhålls med 100 mM CaCl2. Det fanns dock inga tydliga korrelationer mellan transformationsfrekvenser och kemiska egenskaper hos livsmedlen (Ca2 + eller Mg2 + -koncentrationer och pH), vilket tyder på att komplexa faktorer inom livsmedel påverkar kompetensutvecklingen. Liknande effekter av livsmedel vid inducering av transformation har rapporterats i E. coli (Bauer et al., 1999) och Bacillus subtilis (Brautigam et al., 1997; Zenz et al., 1998).

PT i Solid-Air Biofilm

Många bakterier finns som biofilm i naturliga och artificiella miljöer (Davey och O’Toole, 2000). Biofilmer är aggregat av mikrober som bildas vid gränssnitt med fast-vätska eller fast luft (SA) (Anderl et al., 2000; Carmen et al., 2004). Celler i dessa kulturer med hög densitet interagerar med varandra och uttrycker distinkta fysiologiska funktioner jämfört med deras fria planktonformer. Tidigare studier om E. coli-transformation fokuserade uteslutande på planktoniska celler (Mandel och Higa, 1970; Hanahan, 1983), men vi visade att E. coli-celler inom SA biofilm utvecklar kompetens med frekvensen 10−6−10−8 på olika fasta media, inklusive LB och H2O-agar och olika fuktiga livsmedel (Maeda et al., 2004). Levande celler existerar vanligtvis med döda celler i biofilmer, och de senare kan släppa ut deras DNA och vissa tvåvärda metalljoner, inklusive Ca2 + och Mn2 +, i den lokala mikromiljön i biofilmen (Davey och O’Toole, 2000; Whitchurch et al., 2002 ). Dessa förhållanden kan vara gynnsamma för utvecklingen av transformation och kanske inte är exklusiva för SA-biofilmer eftersom en liknande förbättring av E. coli luftvätskebiofilmer också har rapporterats (Król et al., 2011).

PT av Wild E. coli Stammar i vatten

Våra och andras resultat tyder på att miljömässiga E. coli potentiellt kan förvärva främmande DNA via transformation. Det finns dock få tidigare rapporter om undersökningar av omvandlingsförmågan hos naturliga E. coli-stammar (Woegerbauer et al., 2002; Sinha och Redfield, 2012). Därför undersökte vi potentialen hos naturliga E. coli-stammar att utveckla kompetens under miljöförhållanden. Vi använde en standard E. coli-samling av referensstammar (ECOR) -stammar som vår modell av naturliga E. coli (Ochman och Selander, 1984) eftersom dessa ECOR-stammar har använts i stor utsträckning i olika studier om fysiologi, beteende och genotypisk variation av naturlig E. coli (Tenaillon et al., 2010). Vi fann att vissa ECOR-stammar uppvisade detekterbar transformerbarhet (10−10−10−11) i naturligt vatten (kommersiellt tillgängligt naturligt rent vatten på flaska) vid konstanta och varierande temperaturer mellan 5 och 35 ° C och vid vintertemperaturer i ett fältförsök, vilket tyder på att naturlig E. coli potentiellt kan utveckla kompetens under vissa förhållanden som möjligen kan förekomma i miljön (Matsumoto et al., 2016b).

Horisontell plasmidöverföring genom transformation i E. coli

Frysa-tina-inducerad HPTT i naturliga vatten och matextrakt

I miljön kan naken DNA tillföras naturligt från döda celler till angränsande celler inom samma livsmiljö eller mikromiljö.Därför är det värt att undersöka möjligheten för HPTT i ett slutet system under några möjliga förhållanden. Frysning / tining är en vanlig process vid hantering av livsmedel och förekommer också i naturen. Frys-tining-behandling av E. coli-celler kan främja DNA-läckage från döda celler och efterföljande upptagning av överlevande celler eftersom de svarar på värmechock, vilket resulterar i transformation in situ (Li et al., 1992; Takahashi et al., 1992). Denna behandling av kondenserade suspensioner av blandade E. coli-stammar i naturligt vatten och matextrakt orsakade in situ lateral överföring av icke-konjugativa plasmider med en frekvens av 10−8−10-10 (Ishimoto et al., 2008). Detta fenomen inträffade även efter 1-2 månaders lagring vid -20 ° C, och dess känslighet för DNas visade att det förmedlades via en transformationsmekanism.

Låg frekvens av HPTT i SA Biofilms

Biofilmer anses vara lämpliga miljöer för transformation på plats eftersom levande och döda celler samexisterar i närheten, och DNA som frigörs från döda celler ackumuleras ofta runt levande celler. Dessutom, som beskrivits ovan, eftersom E. coli-celler kan utveckla blygsam kompetens inom SA-biofilmer (Maeda et al., 2004), bidrar båda dessa faktorer till HPTT i biofilm. Genom att helt enkelt samodla en plasmidfri stam med en som rymmer en icke-konjugativ plasmid i en SA-biofilm på antibiotikafritt agarmedium, producerades transformerade celler med låg frekvens (10−9-10-10) inom 24-48 timmar (Maeda et al., 2006). Vätskekulturer av samma stammar i LB-buljong producerade inga eller få transformanter, vilket tyder på vikten av SA-biofilmbildning för plasmidöverföring. I huvudsak inträffade samma fenomen i SA-biofilmer på livsmedelsbaserade medier (Ando et al., 2009). Detta fenomen inträffade också mellan populära laboratoriestammar såsom DH5, HB101 och MG1655 (Etchuuya et al., 2011), som är lysogena fagfria och konjugativa apparatsfria, vilket tyder på att den låga frekvensen av horisontell plasmidöverföring i SA-biofilmer kan inträffar utan hjälp av fager eller konjugeringsmaskiner och därför att denna DNA-överföring beror på en sorts transformation. Eftersom rpoS- mutation inte påverkade denna HPTT (Maeda et al., 2006) är det dock osannolikt att den RpoS-beroende mekanismen (Zhang et al., 2012) är inblandad.

Hög frekvens av HPTT Framkallad av P1-fag kunde ofta överföra plasmiden i en blandad cellodling även i ett flytande medium (Etchuuya et al., 2011). Denna HGT visades vara en typ av transformation eftersom den högfrekventa plasmidöverföringen (10−5−10−8) var DNas-känslig. Ytterligare studier avslöjade att detta fenomen uppvisar vissa specifika egenskaper: (1) befordran med proteinhaltig faktor frisatt från CAG18439 (Etchuuya et al., 2011); (2) befordran med en 88-bp sekvens på pHSG299 (Sobue et al., 2011); (3) hög överföringsfrekvens (Etchuuya et al., 2011; Sobue et al., 2011); och (4) beroende av specifika gener (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012). Med avseende på (1) avslöjade en senare studie att dessa proteinhaltiga faktorer inkluderar en P1vir-fagpartikel (eller ett derivat därav) och att externt tillsatt P1vir-fag kan reproducera horisontell plasmidöverföring mellan E. coli-celler och de tre andra huvudfunktionerna i CAG18439 -beroende HPTT (Sugiura et al., 2017). Detta fenomen var också till stor del DNas-känsligt, vilket antyder att en stor del av denna plasmidöverföring beror på transformation trots involvering av P1-fag. Transformationsmekanismen för P1vir-faginducerad plasmidöverföring kan bero på faginfektion eller spontan uppvaknande av lysogeniserad fag i plasmidinnehållande celler, vilket leder till celllys och efterföljande intracellulär plasmid-DNA-frisättning i en användbar form för transformation. Även om en sådan mekanism i allmänhet är genomförbar har det funnits få tydliga demonstrationer av den i E. coli. En nyligen genomförd studie av Keen et al. (2017) med användning av andra fagsystem visade också en liknande faginducerad transformationsmekanism i E. coli. HPTT av P1vir eller CAG18439 kan emellertid inte förklaras adekvat endast genom förbättrad DNA-tillförsel från faginducerad celllys, och den skiljer sig från enkel transformation i E. coli (Hanahan, 1983) när det gäller dess särskiljande egenskaper (2–4). Med avseende på (2) är 88-bp-sekvensen på pHSG299 inte homolog med den del av P1-faggenomsekvensen. Denna sekvens finns ofta i databaser bland generella kloningsvektorsekvenser men inte i någon naturlig källa. Genom att spåra konstruktionsprocessen för pHSG299 (Hashimoto-Gotoh et al., 1981; Brady et al., 1984; Takeshita et al., 1987), misstänker vi emellertid att 88-bp-sekvensen härstammar från R6-5, en konjugativ R-plasmid.Denna sekvens och liknande DNA-element kan bidra till HPTT av R och andra plasmider i miljön. Med avseende på (3) kan denna högfrekventa överföring inte förklaras med den enkla PT-förmågan hos CAG18439 och andra stammar som används eftersom enkel PT i dessa stammar under ekvivalent odlingsförhållande var 105-102 gånger mindre frekvent (Etchuuya et al., 2011). Det föreslogs därför att en CAG18439-härledd proteinhaltig faktor, med en storlek uppskattad mellan 9 och 30 kDa (Etchuuya et al., 2011) också kunde vara involverad i att främja HPTT. Denna faktor hjälper antagligen till DNA-upptag av mottagarceller, troligen i kombination med 88-bp-sekvensen på transformerande DNA. Slutligen, med avseende på (4), föreslog senare genomgående screeningstudier för mottagargener involverade i HPTT att flera gener deltar i mekanismen (Kurono et al., 2012; Matsuda et al., 2012; Shibata et al., 2014a ). Dessa inkluderar de som inte har rapporterats vara involverade i naturlig eller artificiell transformation i E. coli (såsom rodZ) och några kända kompetensgenhomologer, såsom ybaV och yhiR (Finkel och Kolter, 2001; Palchevskiy och Finkel, 2006 ), men inkluderar inte rpoS och andra gener relaterade till den RpoS-beroende mekanismen (Zhang et al., 2012). Sammantaget pekar dessa resultat mot en okänd, komplex mekanism för faginducerad, högfrekvent HPTT som delvis kan dela vägen för naturlig transformation.

HPTT mellan naturliga E. coli-stammar

För att ytterligare bedöma generaliteten och variationen av HPTT i E. coli-stammar användes naturliga stammar (de ovan nämnda ECOR-stammarna) i en studie av HPTT. Flera kombinationer av ECOR-stammar samodlades i flytande media, vilket resulterade i DNas-känslig horisontell överföring av naturliga antibiotikaresistensgener (Matsumoto et al., 2016a, b). Plasmidisolering från dessa nya transformanter visade horisontell plasmidöverföring mellan ECOR-stammar (Matsumoto et al., 2016a, b). Enkla PT-experiment med samma ECOR-stammar avslöjade att HPTT förekommer mycket oftare (10−6−10−8) än enkel PT (under 10−10) under samma odlingsförhållanden, vilket tyder på att HPTT är unikt och effektivt. Dessutom upptäckte vi att 6 av 12 kombinationer av ECOR-stammar, varav några inte ger några plackbildande fager (Shibata et al., 2014b), uppvisade DNas-känslig genöverföring, vilket ledde oss till att misstänka att HPTT är ganska vanligt i naturligt E. coli-stammar. Sammantaget föreslår dessa data att vissa fag- och konjugationsfria transformationsmekanismer också finns naturligt i vissa E. coli-stammar och att HPTT av antibiotikaresistenta naturliga plasmider (såsom plasmider av ECOR24-stammen: Accessionsnummer AB905284 och AB905285) kan vara en väg för att producera multidrugsresistenta naturliga E. coli-celler.

Möjliga mekanismer och genomförbarhet av PT och HPTT i E. coli i miljön

Exempel på PT och frysning-upptiningsinducerad och lågfrekvent HPTT som introducerades i denna mini-recension är förmodligen mer relaterade till den porbildande mekanismen än den kompetensgenberoende mekanismen eftersom livsmedel och naturliga vatten ofta innehåller mM-nivåer av Ca2 + och Mg2 + -joner al., 1996, Bauer et al., 1999; Maeda et al., 2003) och biofilmmiljön förser levande celler med innehållet av döda celler, inklusive tvåvärda metalljoner och transformerbar plasmid-DNA. Som vi beskrev tidigare (Maeda et al., 2006) innehåller en SA biofilm (diameter, 10–12 mm; tjocklek, 0,5–0,8 mm) cirka 2-5 × 109 celler. Dessutom uppgår tarmbakterier i däggdjur i allmänhet till cirka 1011 celler / g (Zoetendal et al., 2004; Sekirov et al., 2010). Med tanke på den enorma miljön, kan inte ens transformationsfrekvenser på 10−9−10−10 underskattas eftersom de kommer att påverka bakteriepopulationerna.

Högfrekvent HPTT som beskrivs i denna artikel kan innebära inte bara den porbildande mekanismen utan också en del av kompetensgenens funktioner och möjligen en annan okänd mekanism, som nämnts ovan. Eftersom bakteriofager är en av de vanligaste organismerna i biosfären och allestädes närvarande i miljön (Clokie et al., 2011), anses faginducerad HPTT också vara genomförbar i miljön, liksom vanlig transduktion och andra fag-härledda sätt för HGT, t.ex. genöverföringsmedel (Lang et al., 2012).

Slutsats och perspektiv

Sammantaget visar våra resultat och relaterade tidigare data att flera mekanismer inducerar transformation- typ HGT i E. coli baserat på olika miljö- och cellulära omständigheter såsom mediets natur (t.ex. vatten och mat), variabel temperatur från under noll till ~ 40 ° C, hög celltäthet i biofilmer och varierande genetisk bakgrund av de inblandade stammarna. Bidraget från HGT av transformationstyp till genetisk dynamik i miljön kan underskattas (Bushman, 2002; Thomas och Nielsen, 2005), och våra studier tyder på att HPTT i E.coli förekommer vid betydande överföringsfrekvenser (10−5−10−10) under de förhållanden som möjligen kan påträffas i miljön. Därför kan transformationstyp HGT bidra till spridningen av antibiotikaresistensgener och framväxten av multiresistenta bakterier i den verkliga miljön utanför laboratorier. Ytterligare studier krävs för att förstå den exakta rollen och bidraget hos transformationstyp HGT vid spridning av antibiotikaresistens.

Författarens bidrag

HH, ES och SM skrev uppsatsen.

Finansiering

Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (bidrag # 25292051).

Uttalande om intressekonflikt

Författarna förklarar att forskningen var genomförs i avsaknad av kommersiella eller ekonomiska förhållanden som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Bekräftelse

Vi är tacksamma mot Enago (www.enago.jp) för engelska redigering och korrekturläsningstjänster.