Experimentell metod

Precis som formeln som används för att beräkna signal / brusförhållandet kan ha en dramatisk effekt på uppenbar känslighet hos någon speciell spektral dataset, instrumentets hårdvarukonfiguration och de experimentella parametrarna för datainsamlingen har också en dramatisk effekt på kvaliteten på det förvärvade spektrumet.

Det finns många hårdvaruparametrar, inställningar och alternativ som alla påverkar den uppmätta känsligheten hos en spektrofluorometer. Detta kan göra det extremt svårt att absolut jämföra den relativa känsligheten för två olika instrument, om de inte används på ett praktiskt taget identiskt sätt. Nedan diskuterar vi var och en av dessa faktorer och vilken inverkan de har på de resulterande uppgifterna.

Tillämpligt på alla skanningsfluorometrar

Excitationsvåglängd: Excitationsvåglängden bör vara identisk för alla system som jämförs. HORIBA-metoden använder 350 nm excitation för Raman-vattnet, liksom de flesta andra tillverkare. När det är spännande vid 350 nm har Ramans utsläppsband för vatten en topp vid 397 nm.

Det är tur att de flesta tillverkare har standardiserat på denna exciteringsvåglängd, eftersom det möjliggör bättre jämförelse. Det är dock helt giltigt att flytta exciteringsvåglängden till något annat värde som ett sätt att testa känslighet i ett annat våglängdsområde (t.ex. NIR).

Emissionsskanningsområde: HORIBA-metoden skannar utsläppsmonokromatorn. från 365 till 450 nm, med steg om 0,5 nm, för att samla upp hela Raman-toppen vid 397 nm och även bakgrunden vid 450 nm.

Bandbredd (slitsstorlek): HORIBA-metoden använder 5 nm bandpass slitsar på både excitations- och emissionsspektrometrarna. Vissa tillverkare specificerar 10 nm slitsar som har effekten att öka känsligheten jämfört med 5 nm. Det har rapporterats att en fördubbling av den fysiska slitsstorleken vid ingången och utgången av en monokromator kan fyrdubbla intensiteten av excitation och utsläppsdetekteringsflödet eftersom genomströmningen går när kvadraten för storleken ökar, men detta är en förenklad uppskattning som bör mätas empiriskt. HORIBA har mätt faktorskillnaden med HORIBA Fluoromax och observerat att för Fluoromax ökar det totala förhållandet mellan signal och brus för Raman-bandet med en faktor på mer än 3 gånger genom att fördubbla slitsstorleken från 5 till 10 nm. Detta kommer dock att vara annorlunda för alla fluorometrar, så var noga med att jämföra med identiska bandpass.

Integrationstid (eller responstid): Detta refererar till hur länge detektorn får samla en signal vid en given stegposition för våglängd. Det spelar också en viktig roll i den totala känsligheten som mäts för en fluorometer. HORIBA-metoden använder en integreringstid på 1 sekund vid varje våglängdspunkt, liknande andra tillverkare. Vissa tillverkare anger emellertid en responstid på 2 sekunder, vilket ökar det totala förhållandet mellan signal och brus med nästan en faktor två. Var noga med att använda samma integrationstid (responstid) när du jämför.

PMT-typ: De flesta spektrofluorometrar använder en fotomultiplikatorrör (PMT) som sin enda detektor för fluorescensemission, utan att ändra detektorhöljet. Detta gäller för de flesta analysbaserade analytiska fluorometrar. Några av dessa bänksystem möjliggör val av olika individuella PMT: er med olika våglängdsintervall och specifikationer. PMT: er som inte upptäcker så långt in i NIR som andra PMT: er kommer att ha ett lägre mörkt antal, så att de ger ett bättre signal / brusförhållande inom området 350 till 400 nm, men de kanske inte kan användas i hela emissionsvåglängden önskat intervall för ett visst laboratorium. HORIBA: s standard PMT som används i FluoroMax Plus, Fluorolog3 och QuantaMaster 8000-serien av fluorometrar är Hamamatsu R928P PMT, som anses vara industristandard för fluorometer. I dessa fall, se till att varje fluorometer använder samma PMT, där det är möjligt.

Optiska filter: Ett optiskt filter kan läggas till den optiska vägen för en fluorometer, antingen på excitationssidan eller utsläppssidan av provet. Dessa kan placeras manuellt i en filterhållare inuti provfacket, eller de kan vara en del av ett filterhjul som automatiskt kan placera olika filter i den optiska banan när olika experimentprotokoll väljs. Optiska filter har effekten att de avvisar ljuset vid givna våglängder, och de kan dramatiskt förbättra signal-brusförhållandet för en fluorometer. HORIBA använder inga optiska filter, förutom själva skanningsspektrometrarna, när SNR för vattenraman specificeras med specifikationerna för Fluoromax, Fluorolog3 eller QuantaMaster 8000-serien.När du jämför en HORIBA-fluorometer med en fluorometer som använder automatiserade filter, använd inte ett filter, eller om det är automatiskt, bekräfta vilket filter och vilken typ av filter som används, och var de används, för att replikera en liknande experimentell metod med en HORIBA-fluorometer.

Gäller för modulära forskningsfluorometrar

Detektortyp: Modulära forskningsfluorometrar inkluderar vanligtvis ett PMT-hölje som standard, men möjliggör olika typer av enkelkanaldetektorer för att förlänga våglängden intervall eller fluorescens livslängd för ett instrument. Alternativa detektorer inkluderar kylda PMT-höljen, olika halvledardetektorer som InGaA, MCP PMT och så vidare. Dessa olika typer av detektorer kommer att ha dramatiska effekter på signal / brusförhållandet för en viss provmätning, så här igen, när du försöker jämföra känsligheten hos en fluorometer mot en annan, se till att samma detektortyp används för att samla in data på båda systemen.

Detektortemperatur: De flesta kommersiella spektrofluorometrar använder PMT-höljen som inte är kylda, och i själva verket erbjuder många instrument inte ens ett kylt detektoralternativ. Ett kylt PMT-hölje kan förbättra känsligheten hos ett instrument genom att minska mörkerantalet (bakgrund) jämfört med samma exakta PMT i ett omgivande hölje. HORIBA: s standard PMT-höljen i FluoroMaxPlus, Fluorolog3 och QuantaMaster 8000 är omgivande PMT-höljen, men Fluorolog3- och QuantaMaster 8000-serierna erbjuder kylda PMT-höljen som tillval för att förbättra känsligheten och NIR-detektering. När du jämför modulära forskningsfluorometrar, se till att jämföra data som samlats in med samma typ av PMT-hölje (omgivande eller kylt), och om det kyls, kyls det också till samma temperatur.

Single Versus Double Monochromator: Modular forskningsfluorometrar tillåter en forskare att välja enstaka eller dubbla monokromatorer antingen på excitations- eller emissionsoptisk väg. Här avser termen dubbel monokromator två spridande gittersteg, en efter en, med en ingångsslits, mellanliggande slits och utgångsslits. En dubbel monokromator kan konfigureras antingen i tillsats- eller spridningsläge, men i båda fallen är genomströmningen och strålkastaregenskaperna hos en enda kontra en dubbel monokromator väldigt olika och kommer att ha stor inverkan på SNR för en vattenraman-skanning, även om bandbredderna, integreringstiderna och våglängderna hålls konstanta.

Spårdensitet hos galler: Spårets densitet hos ett galler kommer också att påverka genomströmningen och därmed känsligheten hos en spektrofluorometer. För de flesta spektrofluorometrar är detta inte alltför stort problem eftersom systemen är tillverkade med endast ett speciellt galler. I det här fallet är det viktigaste att se till att bandpass är valda för att vara desamma. Men för modulära fluorometrar kan du konfigurera monokromatorerna med olika gitter eller flera gitter. För dessa system måste du vara mycket försiktig med att hålla saker så lika som möjligt. Till exempel när du har två instrument som har liknande brännviddsspektrometrar, kommer att ändra eller reducera känsligheten för samma 5 nm bandpass-inställning om du ändrar räffeldensiteten. HORIBA-metoden använder galler med en spårdensitet på 1200 spår per millimeter.

Blaze Angle of Grating: De galler som valts för en exciterings- eller emissionsmonokromator ger optimal genomströmning vid ett visst våglängdsband, kallat flamman vinkeln eftersom detta bestäms av vinkeln för gitteretsning som ges på gitterytan. Som sådan skulle en excitationsmonokromator med en 350 nm flammad excitationsmonokromator och en 400 nm emissionsmonokromator vara optimala val för att uppnå den bästa Raman-känsligheten för vatten vid spänning vid 350 nm. Eftersom de flesta fluorometrar inte tillåter dig att justera gallret, är denna variabel inte en faktor, men för de som tillåter dig att välja galler, se till att välja galler med samma eller mycket liknande, flammvinkel för att göra en giltig jämförelse .